一种肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒及其应用的制作方法

文档序号:18145669发布日期:2019-07-10 11:47
一种肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域,具体涉及一种肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒,该试剂盒利用大肠埃希菌O157:H7和大肠埃希菌O55:H7菌株独有的lpf2C基因型,以及两种细菌中lpf2D基序的差异作为分子标记,利用该序列设计两对特异性的引物,通过常规PCR扩增特征性基因片段进行检测。



背景技术:

埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli) 是革兰氏染色阴性,呈杆状的兼性厌氧菌,通常存在于温血动物的胃肠道。其中,血清型O157:H7大肠杆菌是肠出血型大肠杆菌(enterohemorrhagic E. coli, EHEC)中最重要的一类,在世界范围内引起人类和动物的爆发感染。该菌感染剂量低,侵入人体后,可以引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症等,具有非常重要的公共卫生意义。为了及时、准确地监控可能发生的爆发感染,建立敏感、特异和可靠的技术用于快速而选择性的检测大肠杆菌O157:H7 是极其必要的。

实验室对大肠杆菌O157:H7的传统鉴定方法基于选择性培养基,该方法要求分离纯化菌株,然后再选择性培养基上划线培养,全部流程耗时长,人力成本高,同时根据显色反应造成的误判结果也多,不利于对该类细菌的监控快速、准确的要求。近年来,由于分子生物学技术的发展,运用PCR 技术检测大肠杆菌O157:H7的方法也有很多被建立,选择志贺毒素stx1 和stx2、LEE毒力岛eae、菌毛fimA、鞭毛fliC等基因中的一个或者多个作为分子标记。然而虽然鉴定该类基因可以在一定程度上帮助对O157:H7菌株的预警,但由于大多基因并不是O157:H7菌株所独有,因此其结果也并非100%的可靠。

长极性菌毛(LPF)是大肠杆菌中广泛存在的一类菌毛,根据其在细菌基因组的位置可以分为LPF1型和LPF2型,而对LPF操纵子的基序分析后,可以再将LPF1分为5个基因型,LPF2分为3个基因型。本研究团队根据GenBank上已有的O157:H7全基因组数据分析显示,全部O157:H7菌株包含独有的LPF1-3和LPF2-2基因型菌毛的操纵子,说明该操纵子内基因可以作为候选分子标记。但是该两种基因型的菌毛操纵子同时还存在于O157:H7菌株的祖源菌株O55:H7菌株中,并不能直接用于O157:H7菌株的判定。



技术实现要素:

本发明所要解决的技术问题是:提供一种快速、简便、特异性强、适合临床使用的特异性PCR检测试剂盒,用于快速鉴别大肠杆菌O157:H7菌株。

为解决上述技术问题,本发明的技术方案为:提供一种肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒,所述试剂盒包括两组引物,第一组引物用于检测O157:H7与O55:H7菌株独有的lpf2C基因,上、下游引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;第二组引物用于排除O55:H7菌株,上、下游引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

优选的,所述试剂盒还包括PCR 预混液和DNA 聚合酶,其中预混液包括:10×PCR 缓冲液、dNTPs、MgCl2。

上述试剂盒的使用方法, 其具体步骤为:

(1)提取待测样本核酸,使用第一组引物进行PCR扩增反应;

(2)对步骤(1)扩增阳性的样本核酸,使用第二组引物进行PCR扩增反应;

(3)第一轮PCR反应阳性且第二轮PCR反应阴性的样本为肠出血性大肠埃希菌O157:H7。

本发明公开了大肠杆菌LPF2操纵子的lpf2Clpf2D基因作为监测、鉴别O157:H7大肠杆菌的分子标记的应用。

与现有技术相比,本发明所述技术方案的优点在于:

1.标记基因为O157:H7和O55:H7所独有的,对于第一步阳性的样品通过第二步PCR,可以区分菌株是O157:H7或是O55:H7菌株,特异性好。

2. 用于检测、监测临床样品中O157:H7大肠杆菌,已通过多株O157:H7和O55:H7 菌株PCR检测验证,该PCR检测方法得出的结果准确无误,且没有假阳性和相互交叉反应的发生。

2.该检测方法所需的试剂及设备成本较低,设计合成的检测引物-20℃可以长期保存,能多次使用。

附图说明

图1为F1和R1引物特异性快速检测PCR产物电泳图。其中:

M为DL2000分子标记,泳道1为大肠杆菌O157:H7标准株EDL933,泳道2为O157:H7标准株NCTC 12900,泳道3为O157:H7野生株JS157-1,泳道4为O157:H7野生株JS157-2,泳道5为O157:H7野生株JS157-3,泳道6为O157:H7野生株JS157-4,泳道7为大肠杆菌O55:H7标准株G58,泳道8为O55:H7野生株JS55-1,泳道9为O55:H7野生株JS55-2,泳道10为O55:H7野生株JS55-3,泳道11为大肠杆菌O55:H6标准株CMCC(B)44336,泳道12为大肠杆菌O26标准株CMCC(B) 44389,泳道13为大肠杆菌O45标准株CMCC(B) 44407,泳道14为大肠杆菌O113标准株CMCC(B) 44474,泳道15为大肠杆菌O121标准株CMCC(B) 44717,泳道16为大肠杆菌O145标准株CMCC(B) 44740,泳道17为黏附侵袭大肠杆菌标准株LF82,泳道18为K99大肠杆菌标准株C83907,泳道19为空肠弯曲菌标准株ATCC 33291,泳道20为肺炎克雷伯标准株CMCC(B) 46117,泳道21为福氏志贺氏菌标准株CMCC(B) 51572,泳道22为鼠伤寒沙门菌标准株ATCC 14028,泳道23为肠炎沙门菌CMCC(B) 50336,泳道24为魏氏梭菌标准株C59。

图2为F2和R2引物特异性快速检测PCR产物电泳图。其中:

M为MARK I DNA Ladder分子标记,泳道1为大肠杆菌O157:H7标准株EDL933,泳道2为O157:H7标准株NCTC 12900,泳道3为O157:H7野生株JS157-1,泳道4为O157:H7野生株JS157-2,泳道5为O157:H7野生株JS157-3,泳道6为O157:H7野生株JS157-4,泳道7为大肠杆菌O55:H7标准株G58,泳道8为O55:H7野生株JS55-1,泳道9为O55:H7野生株JS55-2,泳道10为O55:H7野生株JS55-3。

具体实施方式

本发明的实验基础是:由于LPF2-2操纵子是O157:H7菌株和O55:H7菌株所独有的保守基因序列,根据其中lpf2C基因保守区域设计第一组引物。当待检菌株模板可以特异性扩增预期659 bp大小的条带时,说明该待检菌株为O157:H7菌株或O55:H7菌株;当模板不能扩增相应条带,则该待检菌株非O157:H7菌株。

此外,本实验室前期研究通过比对大量LPF基序后还发现,O157:H7菌株的LPF2-2操纵子中lpf2D基因在第74位较O55:H7菌株缺失序列TTTGTTTTAATAGTGATGGCG。该序列则可以用于对O157:H7菌株和O55:H7菌株的进一步区分。因此设计第二组引物,其中上游引物的3’端包含TTTGTTTTAATAGTGATGGCG中的部分序列,下游引物在lpf2D保守区。使用第一组引物检测结果为阳性的样品模板,对第二组引物进行PCR扩增,可以特异性扩增预期376 bp大小的条带时,说明该待检菌株为大肠杆菌O55:H7菌株;当模板不能扩增相应条带,则该待检菌株是大肠杆菌O157:H7菌株。

实施例1引物设计

根据GenBank 上发表的大肠杆菌O157:H7 Sakai株(登录号:NC_002695.2)和O55:H7 CB9615株(登录号:CP001846.1)特有的LPF2-2型操纵子基序设计上下游引物F1和R1,其核苷酸序列为 SEQ ID NO:1 和SEQ ID NO:2。由该引物扩增大肠杆菌O157:H7获得保守基因片段为659 bp,其核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

再根据O157:H7Sakai株的LPF2-2操纵子中的lpf2D基因在第74位较O55:H7 CB9615株缺失序列TTTGTTTTAATAGTGATGGCG的特征设计第二轮引物F2和R2,其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。由该引物扩增O55:H7 CB9615株可得保守基因片段为376bp,其核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

实施例2本发明所述肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒特异性试验

采用本发明所述试剂盒分别对大肠杆菌O157:H7标准株EDL933和NCTC 12900,O157:H7野生株JS157-1、 JS157-2、JS157-3和JS157-4,O55:H7标准株G58,O55:H7野生株JS55-1、JS55-2和JS55-3; O55:H6标准株CMCC(B) 44336, O26标准株CMCC(B) 44389, O45标准株 CMCC(B) 44407, O113标准株CMCC(B) 44474,O121标准株CMCC(B) 44717, O145标准株CMCC(B) 44740,黏附侵袭大肠杆菌标准株LF82,K99标准株C83907,以及其他种属肠道细菌即空肠弯曲菌标准株ATCC 33291,肺炎克雷伯标准株CMCC(B) 46117,福氏志贺氏菌标准株CMCC(B) 51572,鼠伤寒沙门菌标准株ATCC 14028,肠炎沙门菌CMCC(B) 50336,魏氏梭菌标准株C59进行检测。提取上述菌株核酸分别进行下述两轮PCR验证实验。第一轮PCR反应:参照TaKaRa TaqTM说明书配置PCR反应体系(20 μL),以上述菌株核酸为模板,采用引物F1和R1进行扩增,PCR反应条件为:95℃预变性5min,94℃ 15s,50℃退火15s,72℃延伸30s,25个循环;72℃再延伸5min;扩增产物通过琼脂糖电泳进行检测验证。结果如图1所示:大肠杆菌O157:H7标准株EDL933和NCTC 12900,O157:H7野生株JS157-1、JS157-2、JS157-3和JS157-4,O55:H7标准株G58,O55:H7野生株JS55-1、JS55-2和JS55-3均可以扩增出约659bp大小条带。而其他菌株均不能扩增出任何条带。

第二轮PCR反应:参照TaKaRa TaqTM说明书配置PCR反应体系(20 μL),以第一轮PCR反应阳性结果的菌株核酸为模板,采用引物F2和R2进行扩增,PCR反应条件为:95℃预变性5min,94℃15s,51℃退火15s,72℃30s,25个循环,72℃再延伸5min,扩增PCR 产物;扩增产物再次通过琼脂糖电泳进行检测验证。结果如图2所示:只有O55:H7菌株G58、JS55-1、JS55-2和JS55-3可以扩增出约376bp大小条带。而大肠杆菌O157:H7菌株EDL933、NCTC 12900、JS157-1、JS157-2、JS157-3和JS157-4扩增后无条带。

综上所述本发明所述试剂盒特异性好,且没有假阳性和相互交叉反应的发生。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgggttatc gctactctay 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaggtcactc mgtcacta 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctaatggtg atggcgtttg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgaggtgga ttggttgga 19

<210> 5

<211> 659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgggttatc gctactctay ggaggggttc tacaccctca atgaatgggt gtcgcgacag 60

gataatgatt ctgatttctg ggtaacgggc aaccgtcgca gccgcttcga aggcacctgg 120

acgcaatctt tcacgccagg ctggggcaat atttatttaa cattcagtcg acaggaatac 180

tggcagaccg atgaggtcga acgtttatta cagttcggct ataacaacaa ctggcgaaac 240

atctcctgga acgtttcctg gaactatacg gactcgatca agcgctcatt gggcaaccat 300

catgatgata acaatgatga tttcggcaaa gaacagattt tcatgttctc aatgtcgata 360

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<211> 376

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtgcttgagc gcactcttaa tgggttaaat tactatgctc tgaatgatta tttatcggtc 300

ggcgtgacga tttttattat taataaccaa tatgcggcca ttccttttga acacttatcc 360

aaccaatcca cctcac 376

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