结合抗髓鞘相关糖蛋白的IgM抗体的碳水化合物配体的制作方法

文档序号:18631957发布日期:2019-09-06 23:53
结合抗髓鞘相关糖蛋白的IgM抗体的碳水化合物配体的制作方法

发明领域

本发明涉及结合抗髓鞘相关糖蛋白(MAG)的IgM抗体的碳水化合物配体,包含它们的聚合物,并且涉及它们在诊断和治疗抗-MAG神经病变中的应用。

发明背景

抗髓鞘相关糖蛋白神经病变是脱髓鞘外周神经病变,其由识别抗原HNK-1碳水化合物表位的自身抗体引起,并发现于外周神经系统(PNS)的髓鞘相关糖蛋白(MAG)和其他糖复合物中。临床表现的特征是缓慢进展的脱髓鞘神经病变,主要是感觉神经病变。已良好地建立了高水平抗体和脱髓鞘的相关性。因此,对患者的神经活检的病理研究显示脱髓鞘和髓鞘薄片加宽,以及髓鞘上抗-MAG IgM的沉积。另外,IgM抗体浓度的治疗性降低导致神经病变症状的临床改善(A.J.Steck等人,Current Opinion in Neurology 2006,19:458–463;M.C.Dalakas,Current Treatment Options in Neurology 2010,12:71–83)。

包含HNK-1表位的髓鞘糖复合物包括糖蛋白MAG,蛋白0(P0)、外周髓鞘蛋白-22(PMP22)以及糖脂磺基葡糖醛酸基红细胞糖苷酯(SGPG)和磺基葡糖醛酸基半乳糖胺基红细胞糖酐酯(SGLPG)。几个观察结果表明MAG作为IgM抗体的主要靶标:(i)患者的抗体在PNS位点的沉积与MAG共存,(ii)MAG从髓鞘选择性地丢失,以及(iii)人类神经病理学和敲除MAG的小鼠显示特征相似性(R.H.Quarles,Journal of Neurochemistry 2007,100:1431–1448)。

MAG属于唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)家族。它主要位于在CNS中胶质细胞和PNS中雪旺氏细胞的轴周细胞膜中,并参与在轴突-神经胶质界面的粘附和信令过程(R.H.Quarles,2007,loc.cit.)。MAG是强烈糖基化的,即其30%的分子量是由异质N-连接寡糖贡献的。MAG的所有8个潜在的N-糖基化位点可携带HNK-1表位。携带HNK-1表位的两种糖脂(SGPG,SGLPG)含有作为特定标志的3-O-磺基葡糖醛酸(SO3-3GlcA),(T.Ariga et al.,J Biol Chem 1987,262:848-853)。有趣的是,牛糖蛋白P0的HNK-1表位的结构也包含此特征。三种所阐明的结构之间的相似性被限制在三糖末端。因此,HNK-1表位被定义为SO3-3-GlcA(β1-3)Gal(β1-4)GlcNAc-OH。

由IgM抗体识别的精确的碳水化合物表位仍不清楚。对SGPG衍生物的研究表明,IgM抗体对羧基和硫酸基有不同的重要性。而含有两个带负电荷的基团的“完整”SGPG被报告为用于抗体结合的最佳表位(A.A.Ilyas et al.,J Neurochemistry 1990,55:594-601),其他研究强调碳水化合物链的长度对于抗体识别的重要性。此外,SO3-3-GlcA(β1-3)Gal二糖表位似乎是用于结合的最低要求(A.Tokuda et al.,J.Carbohydrate Chemistry 1998,17:535-546)。



技术实现要素:

本发明涉及结合抗-MAG IgM抗体的碳水化合物配体,以及其在诊断和治疗抗-MAG神经病变中的应用。

特别是,本发明涉及式(I)和式(II)的二糖,

其中Z是任选被取代的苯基、杂芳基、芳基羰基或杂芳基甲基。

此外,本发明涉及包含多个式(I)和/或式(II)取代基的治疗上可接受的聚合物,其中Z是连接所述取代基至聚合物主链的连接基团。

本发明还涉及包含这些化合物的药物组合物,含有这些化合物的诊断试剂盒,以及这些化合物用于诊断和治疗抗-MAG神经病变中的应用。

附图简要说明

图1.竞争性结合测定的示意图

(a)将涂覆MAG的板与抗-MAG IgM抗体(患者血清)和聚合物25温育;(b)洗涤步骤;(c)与缀合辣根过氧化物酶的抗人IgM抗体温育;(d)洗涤步骤;(e)四甲基联苯胺(TMB)底物的添加;(f)酸性终止溶液的添加和光密度的测量。

图2.化合物1、2和25的结合曲线

图2(a):将涂覆有MAG的孔与化合物1(50mM最高浓度)和四种患者血清MK、DP、KH和SJ(%ab=%结合MAG的IgM抗体)共温育。

图2(b):涂覆有MAG的孔与化合物2(50mM最高浓度)和患者血清MK和SJ一起共温育。

图2(c):与化合物25(15μM最高浓度)和患者血清MK、KH和SJ一起共温育。化合物25是与最小HNK-1表位(1)偶联的具有限定百分比的赖氨酸残基的聚赖氨酸聚合物。使用的一般缩写如下:PL(minHNK-1)x,其中x限定表位载量的百分比,以%表示。在这种情况下,该聚合物是PL(minHNK-1)44。

图2(d):与患者血清KH与聚合物PL(minHNK-1)x一起共温育,其中x为10%、25%、31%和44%(0.5mM最高浓度)。

图2(e):与小鼠单克隆抗HNK-1IgM抗体(一种阳性对照抗体)与聚合物PL(最小HNK-1)x一起共温育,其中x为10%、25%、31%和44%(0.5mM最高浓度)。

发明详述

本发明中鉴定出了仍被抗-MAG IgM抗体可靠识别的最小HNK-1的碳水化合物表位,并制备出了硫酸化形式(式I)和非硫酸化形式(式II)的对应二糖。

本发明涉及式(I)和式(II)的二糖,

其中Z是任选地取代的苯基、杂芳基、芳基羰基或杂芳基甲基。

式(I)中的硫酸基团位于葡糖醛酸的3位。

此外,本发明涉及包含多个式(I)和/或式(II)取代基的聚合物,其中Z是连接取代基至聚合物主链的连接基团。

特别是,连接基团Z是(双官能的)芳基、杂芳基、芳基-低级烷基、芳基羰基或杂芳基甲基,其中芳基或杂芳基被具有3至25个碳原子的与聚合物连接的亚烷基取代,其中任选地:

(a)亚烷基的一个或多个碳原子被携带氢原子的氮替换,并且相邻碳原子中的一个被氧代取代,表示为酰胺官能-NH-CO-;和/或

(b)亚烷基中的一个或多个碳原子被氧替换;

(c)亚烷基的一个或多个碳原子被硫替换;和/或

(d)连接至聚合物的末端碳原子被氧代取代;或者

(e)连接至聚合物的末端碳原子被-NH-替换。

包含多个式(I)和/或式(II)取代基的聚合物(其中Z是连接该取代基至聚合物主链的连接基团)优选为α-氨基酸聚合物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或共聚物或N-乙烯基-2-吡咯烷酮-乙烯醇共聚物。

本发明的聚合物的具体实例是:

(A)聚α-氨基酸,其中该氨基酸带有侧链氨基烷基官能团,如聚赖氨酸,特别是聚-L-赖氨酸或聚-D-赖氨酸,并且氨基被连接至双官能连接基团Z的末端羰基;

(B)聚α-氨基酸,其中该氨基酸带有侧链羰基烷基官能团,如聚天冬氨酸或聚谷氨酸,并且羰基(其分别对应于天冬氨酸和谷氨酸中的原始羧基)被连接至双官能连接基团Z的末端-CH2基团;

(C)聚丙烯酸,聚甲基丙烯酸,或丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物,其中羧基被双官能连接基团Z的末端氨基酰胺化;和

(D)N-乙烯基-2-吡咯烷酮和乙烯醇的共聚物,其中该共聚物的乙烯醇部分的羟基被连接至双官能连接基团Z的末端羰基。

在具体的实施方案中,聚合物(A)包含部分式(III)

其中,

R1是连接至连接基团Z的氨基烷基取代基,其中Z的亚烷基在连接至R1的氨基的末端位置具有氧代基团,

R2是2,3-二羟基丙基硫代乙酰基-氨基烷基,和

聚合物中两个括起来的分别具有R1和R2的基团之间的关系表明了二糖相对于封端的氨基(capped amino)官能团的载量的关系。

例如,R1具有式(IIIa),R2具有式(IIIb),

其中o是1至6,优选为3或4;p是1至6,优选2至4,特别是3;q是1至6,优选1至4,特别是2。

当o为3时,取代基R1表示聚鸟氨酸的侧链,当o为4时,取代基R1表示聚赖氨酸的侧链,其连接至以自由价携带式(I)或(II)的二糖的连接基团Z,R2为2,3-二羟基丙基硫代乙酰基氨基烷基,即具有增溶取代基的封端氨基官能团。

聚氨基酸可以是直链、超支化或树枝状的,如Z.Kadlecova等在Biomacromolecules 2012,13:3127-3137中所述,聚赖氨酸如下:

用于制备式(III)的聚合物(A)的聚赖氨酸优选具有15000至300000的分子量,特别是30000至70000,这种聚合物通过连接基团Z进一步连接到式(I)和/或(II)的化合物,该聚合物优选具有封端的2,3-二羟基丙基硫代乙酰基残基。

在一个具体的实施方案中,聚合物(B)包括部分式(III),

其中,

R1是连接至连接基团Z的羰基烷基取代基,其中Z的亚烷基在连接至R1的羰基的末端位置具有-CH2-基团,

R2是2,3-二羟基丙基硫代乙酰基-羰基烷基,和

聚合物中两个括起来的分别具有R1和R2的基团之间的关系表明了相对于封端的羰基或羧基官能团的二糖载量的关系。

例如,R1具有式(IIIc),R2具有式(IIId),

其中o是1至6,优选为1或2;p是1至6,优选2至4,特别是3;q是1至6,优选1至4,特别是2。

当o为1时,取代基R1表示聚谷氨酸的侧链,当o为2时,取代基R1表示聚天冬氨酸的侧链,其连接至以自由价携带式(I)或式(II)的二糖的连接基团Z,R2为2,3-二羟基丙基硫代乙酰基-羰基烷基,即具有增溶取代基的封端的羧基官能团。

用于制备式(III)的聚合物(B)的聚天冬氨酸优选具有15000至300000的分子量,特别是30000至70000,这种聚合物与连接至式(I)和/或式(II)的化合物的连接基团Z进一步反应,该聚合物优选具有封端的2,3-二羟丙基硫代烷基残基。

在一个具体的实施方案中,聚合物(C)包括部分式(IV),

其中,

R1是连接基团Z,其中Z的亚烷基在连接至(IV)中的羰基的末端位置携带有-NH2-基团,

R2是2,3-二羟基丙基硫代乙酰氨基烷基氨基或相关的氨基取代基,并且

R3是氢或甲基;和

聚合物中两个括起来的分别具有R1和R2的基团之间的关系表明了相对于封端的羧基官能团的二糖载量的关系。

例如,R1具有式(IVa),R2具有式(IVb),

其中q是1至6,优选4至6;r是1至6,优选1至4,特别是2。

在一个实施方案中,R1具有式(IVd),R2具有式(IVe),

其中p是1至10,优选1至4;q是1至6,优选4至6;r是1至6,优选1至4,特别是2。

在另一个实施方案中,R1具有式(IVf),

其中r是1至6,优选1至4,特别是2;并且

R2具有式(IVc)(如上)。

用于制备式(IV)的聚合物(C)的聚丙烯酸优选具有30000至400000的分子量,特别是30000至160000,这种聚合物与连接至式(I)和/或式(II)化合物的连接基团Z进一步反应,该聚合物优选具有封端的2,3-二羟丙基硫代乙酰基残基。

在一个具体的实施方案中,聚合物(D)包括部分式(V),

其中,

R1是连接基团Z,其中Z的亚烷基在连接至(V)中的羟基的末端位置携带有氨基羰基基团,

R2是2,3-二羟基丙基硫代乙酰氨基烷基氨基羰基或相关的氨基羰基取代基,和

聚合物中两个括起来的分别具有R1和R2的基团之间的关系表明了相对于封端的羟基官能团的二糖载量的关系。

例如,R1具有式(Va),R2具有式(Vb),

其中q是1至6,优选4至6;r是1至6,优选1至4,特别是2。

在另一个实施方案中,R1具有式(Vc),R2具有式(Vd),

其中p是1至10,优选1至4;q是1至6,优选4至6;r是1至6,优选1至4,特别是2。

在另一个实施方案中,R1具有式(Ve),R2具有式(Vf),

其中r是1至6,优选1至4,特别是2。

用于制备式(V)的聚合物(D)的共聚物优选具有30000至400000的分子量,特别是30000至160000,这种聚合物与连接至式(I)和/或式(II)化合物的连接基团Z进一步反应,该聚合物优选具有封端的2,3-二羟丙基硫代乙酰基残基。

除非另有说明,本公开上下文中所用的一般术语优选具有下述含义:

前缀“低级”表示具有最高达且包括最大7个,特别是最高达且包括最大4个碳原子的自由基,该自由基是直链或具有单个或多个分支的支链。

其中,复数形式用于化合物、盐等,其也用来指单个化合物、盐等。

原则上双键可具有E-或Z-构型。因此,本发明的化合物可作为同分异构体混合物或单一异构体存在。如果未指定,则表示两种异构形式。

任何不对称碳原子可以以(R)-、(S)-或(R,S)-构型,优选(R)-或(S)-构型存在。因此,该化合物可作为异构体的混合物或纯异构体,优选为对映异构体-纯非对映体存在。

烷基(或连接基团中的双官能亚烷基)具有1至25个,例如1至12个,优选1至7个碳原子,并且是直链或支链的。烷基优选为低级烷基。优选地,(双官能)亚烷基具有3至25个,优选4至12个碳原子。

低级烷基具有1至7个,优选1至4个碳原子,和为丁基,如正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基;丙基,如正丙基或异丙基;乙基或甲基。优选地,低级烷基为甲基或乙基。

环烷基优选具有3至7个环碳原子,并且可以是未取代的或取代的,例如被低级烷基或低级烷氧基取代。环烷基为例如环己基、环戊基、甲基环戊基或环丙基,特别是环丙基。

芳基代表任选地携带取代基的具有5至10个碳原子的单环或双环稠合环芳族基团,例如苯基、1-萘基或2-萘基,或包含苯基的部分饱和的双环稠合环,如二氢茚基、二氢吲哚基、二氢或四氢萘基,全部被任选地取代。优选地,芳基为苯基、二氢茚基、二氢吲哚基或四氢萘基,特别是苯基。

术语“携带取代基的芳基”代表被至多四个独立地选自如下基团的取代基取代的芳基:低级烷基、卤代-低级烷基、环烷基-低级烷基、羧基-低级烷基、低级烷氧基羰基-低级烷基;芳基烷基或杂芳基烷基,其中芳基或杂芳基是未取代的或被至多三个选自低级烷基、环丙基、卤代-低级烷基、低级烷氧基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、四唑基、羧基、卤素、氨基、氰基和硝基的取代基取代;羟基-低级烷基,低级烷氧基-低级烷基,芳氧基-低级烷基,杂芳基氧基-低级烷基,芳基-低级烷氧基-低级烷基,杂芳基-低级烷氧基-低级烷基,低级烷氧基-低级烷氧基-低级烷基;氨基烷基,其中氨基是未取代的或被的一个或两个选自低级烷基、羟基-低级烷基、烷氧基-低级烷基和氨基-低级烷基的取代基取代,或被一个选自烷基羰基或巯基烷基羰基、烷氧基羰基、氨基-低级烷氧基羰基、低级烷氧基-低级烷氧基羰基和氨基羰基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;任选取代的烯基,任选取代的炔基,环烷基,芳基,杂芳基,杂环基,羟基,低级烷氧基,卤代-低级烷氧基,低级烷氧基-低级烷氧基,环烷基-低级烷氧基,芳基氧基,芳基-低级烷氧基,芳基氧基-低级烷氧基,杂芳基氧基,杂芳基-低级烷氧基,杂芳基氧基-低级烷氧基,任选取代的烯基氧基,任选取代的炔基氧基,环烷基氧基,杂环烷基氧基,羟基磺酰基氧基;烷基巯基,羟基亚磺酰基,烷基亚磺酰基,卤代-低级烷基亚磺酰基,羟基磺酰基,烷基磺酰基,芳基磺酰基,杂芳基磺酰基;氨基磺酰基,其中氨基是未取代的或者被一个或多个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、环烷基、任选取代的苯基、任选取代的苯基-低级烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳基-低级烷基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;氨基,其任选地被一个或多个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、二-低级烷基氨基-低级烷基、环烷基、任选取代的苯基-低级烷基和任选取代的杂芳基-低级烷基的取代基取代,或被一个任选取代的苯基、任选取代的杂芳基、烷基羰基、任选取代的苯基羰基、任选取代的吡啶基羰基、烷氧基羰基或氨基羰基取代,并且其中各种情况下烷基或低级烷基可以被卤素、低级烷氧基、芳基、杂芳基或任选取代的氨基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;在甲基处取代的羧甲基氨基或低级烷氧基羰基甲基氨基,使得所得的取代基对应于20种天然存在的标准氨基酸之一,在甲基处取代的氨基甲基羰基氨基,使得所得酰基对应于20种天然存在的标准氨基酸之一;低级烷基羰基,卤素-低级烷基羰基,任选取代的苯基羰基,任选取代的杂芳基羰基,羧基,低级烷氧基羰基,低级烷氧基-低级烷氧基羰基;氨基羰基,其中氨基是未取代的或者被一个羟基或氨基或者一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、环烷基、任选取代的苯基-低级烷基和任选取代的杂芳基-低级烷基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;氰基,卤素,和硝基;并且其中彼此邻位的两个取代基可以形成含有一个、两个或三个氧原子、一个或两个氮原子和/或一个硫原子的5、6或7元碳环或杂环,其中氮原子任选地被低级烷基、低级烷氧基-低级烷基或低级烷基羰基取代。

特别是,取代基可以独立地选自下组:低级烷基,卤代-低级烷基,羟基-低级烷基,低级烷氧基-低级烷基,任选取代的烯基,任选取代的炔基,环己基,环丙基,芳基,杂芳基,杂环基,羟基,低级烷氧基,卤代-低级烷氧基,低级烷氧基-低级烷氧基,环烷氧基,苯氧基,羟基磺酰基氧基;烷基巯基,羟基亚磺酰基,烷基亚磺酰基,卤代-低级烷基亚磺酰基,羟基磺酰基,烷基磺酰基,芳基磺酰基,杂芳基磺酰基;氨基磺酰基,其中氨基是未取代的或者被一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基和任选取代的苯基-低级烷基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;氨基,任选地被一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、二-低级烷基氨基-低级烷基、环烷基中取代基取代,或被一个选自任选取代的苯基、任选地取代的杂芳基、烷基羰基、任选取代的苯基羰基,任选取代的吡啶基羰基、烷氧基羰基或氨基羰基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;在甲基处被取代的羧甲基氨基或低级烷氧基羰基甲基氨基,使得所得的取代基对应于20种天然存在的标准氨基酸之一,在甲基处被取代的氨基甲基羰基氨基,使得所得酰基对应于20种天然存在的标准氨基酸之一;低级烷基羰基,卤素-低级烷基羰基,羧基,低级烷氧基羰基,低级烷氧基-低级烷氧基羰基;氨基羰基,其中氨基是未取代的或者被一个羟基或氨基取代或被一个或两个选自低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、任选地取代的苯基-低级烷基和任选地取代的杂芳基-低级烷基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;氰基,卤素,和硝基;并且其中彼此邻位的两个取代基可以形成含有一个或两个氧原子和/或一个或两个氮原子的5或6元杂环,其中氮原子任选地被低级烷基、低级烷氧基-低级烷基或低级烷基羰基取代。

在任选地取代的苯基中,取代基优选为以下:低级烷基、卤代低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、氨基-低级烷基、酰氨基-低级烷基、环丙基、羟基、低级烷氧基、卤代-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、亚甲基二氧基、羟基-磺酰氧基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基羰基、羟基氨基羰基、四唑基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、卤素、氰基或硝基;特别是低级烷氧基、氨基-低级烷基、酰氨基-低级烷基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基羰基、羟基氨基羰基、四唑基或氨基磺酰基。

杂芳基表示含有选自氮、氧和硫的至少一个杂原子的芳族基团,并且是单环或双环,任选地携带有取代基。单环杂芳基包括含有选自氮、硫和氧的1、2、3或4个杂原子的5或6元杂芳基。双环杂芳基包括9或10元稠环杂芳基。杂芳基的实例包括:吡咯基,噻吩基,呋喃基,吡唑基,咪唑基,三唑基,四唑基,噁唑基,异噁唑基,噁二唑基,噻唑基,异噻唑基,噻二唑基,吡啶基,哒嗪基,嘧啶基,吡嗪基,和这些单环杂芳基的苯并或哒嗪并稠合衍生物,例如吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、吡咯并吡啶、咪唑并吡啶或嘌呤基,全部任选地被取代。优选地,杂芳基是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁二唑基、三唑基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、吡咯基、吲哚基、吡咯并吡啶或咪唑并吡啶;特别是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁二唑基、三唑基、吲哚基、吡咯并吡啶或咪唑并吡啶。

术语“携带取代基的杂芳基”代表被至多三个独立地选自以下的取代基取代的杂芳基:低级烷基、卤代-低级烷基、环烷基-低级烷基、羧基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、烷氧基-低级烷基、杂芳基氧基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷氧基-低级烷基;氨基烷基,其中氨基是未取代的或被一个或两个选自低级烷基、羟基-低级烷基、烷氧基-低级烷基、氨基-低级烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基-低级烷氧基羰基、低级烷氧基-低级烷氧基羰基和氨基羰基的取代基取代;任选取代的烯基,任选取代的炔基,环烷基;芳基,杂芳基,芳烷基,杂芳烷基,其中芳基或杂芳基是未取代的或被至多三个选自低级烷基、卤代-低级烷基、低级烷氧基、卤素、氨基、氰基和硝基的取代基取代;羟基,低级烷氧基,卤代-低级烷氧基,低级烷氧基-低级烷氧基,环烷基氧基,环烷基-低级烷氧基,芳氧基,芳基-低级烷氧基,杂芳氧基,杂芳基-低级烷氧基,烯基氧基,炔基氧基,烷基巯基,烷基亚磺酰基,卤代-低级烷基亚磺酰基,烷基磺酰基,芳基磺酰基,杂芳基磺酰基,氨基磺酰基(其中氨基是未取代的或者被一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、环烷基、任选取代的苯基、任选取代的苯基-低级烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳基-低级烷基的取代基取代),或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;氨基,其任选地被一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、二-低级烷基氨基-低级烷基、环烷基、任选取代的苯基、任选取代的苯基-低级烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基-低级烷基、烷基羰基、烷氧基羰基或氨基羰基的取代基取代,并且其中各种情况下的烷基或低级烷基可以被卤素、低级烷氧基、芳基、杂芳基或任选取代的氨基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;低级烷基羰基,卤代-低级烷基羰基,任选取代的苯基羰基,羧基,低级烷氧基羰基,低级烷氧基-低级烷氧基羰基;氨基羰基,其中氨基是未取代的或者被一个羟基或氨基取代或者被一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、环烷基、任选取代的苯基、任选取代的苯基-低级烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳基-低级烷基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;氰基,卤素和硝基。

特别是,杂芳基上的取代基可独立地选自:低级烷基,卤代-低级烷基,环烷基-低级烷基,低级烷氧基-低级烷基,低级烷氧基-低级烷氧基-低级烷基,任选取代的烯基,任选取代的炔基,环烷基,芳基,杂芳基,羟基,低级烷氧基,环烷氧基,烯基氧基,炔基氧基,烷基巯基,烷基亚磺酰基,卤代-低级烷基亚磺酰基,烷基磺酰基,芳基磺酰基,氨基磺酰基,其中氨基是未取代的或者被一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、环烷基、任选取代的苯基、任选取代的苯基-低级烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳基-低级烷基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;氨基,其任选地被一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、二-低级烷基氨基-低级烷基、环烷基、烷基羰基、烷氧基羰基或氨基羰基的取代基取代,并且其中各种情况下烷基或低级烷基可以被低级烷氧基或任选取代的氨基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;低级烷基羰基,卤代-低级烷基羰基,羧基,低级烷氧基羰基,低级烷氧基-低级烷氧基羰基;氨基羰基,其中氨基是未取代的或者被一个羟基或氨基取代或者被一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基或环烷基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;氰基,卤素和硝基。

在任选取代的杂芳基中,取代基优选为低级烷基、卤代-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、羟基、低级烷氧基、卤代-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、亚甲基二氧基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基羰基、羟基氨基羰基、四唑基、氨基磺酰基、卤素、氰基或硝基。

烯基包含一个或多个,例如两个或三个,双键,并优选为低级烯基,如1-或2-丁烯基、1-丙烯基、烯丙基或乙烯基。

炔基优选为低级炔基,如炔丙基或乙炔基。

在任选取代的烯基或炔基中,取代基优选为低级烷基、低级烷氧基、卤素、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基,并且与烯基或炔基的饱和或不饱和碳原子连接。

杂环基优选表示含有4-10个原子的饱和的、部分饱和的或不饱和的单环或双环,其含有一个、两个或三个选自氮、氧和硫的杂原子,除非另外指明,其可以是碳或氮连接的,其中,环氮原子可以任选地被选自低级烷基、氨基-低级烷基、芳基、芳基-低级烷基和酰基取代,环碳原子可被低级烷基、氨基-低级烷基、芳基、芳基-低级烷基、杂芳基、低级烷氧基、羟基或氧代基取代,或可与任选地取代的苯并环稠合。考虑用于取代的苯并的取代基是上面提到的用于任选地取代的芳基的那些。杂环基的实例是吡咯烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、二氧戊环基、四氢呋喃基和四氢吡喃基,以及这类单环杂环基的任选地取代的苯并稠合的衍生物,例如二氢吲哚基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑啉基、四氢喹啉基和苯并二氢呋喃基。

酰基表示例如烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、芳基-低级烷基羰基或杂芳基羰基。低级酰基优选为低级烷基羰基,特别是丙酰基或乙酰基。

羟基烷基尤其为羟基-低级烷基,优选羟基甲基、2-羟基乙基或2-羟基-2-丙基。

氰基烷基优选代表氰基甲基及氰基乙基。

卤代烷基优选为氟代烷基,特别是三氟甲基、3,3,3-三氟乙基或五氟乙基。

卤素为氟、氯、溴或碘。

低级烷氧基尤其为甲氧基、乙氧基、异丙基氧基或叔丁基氧基。

芳烷基包括如上文所定义的芳基和烷基,并且为例如苄基、1-苯乙基或2-苯乙基。

杂芳烷基包括如上文所定义的杂芳基和烷基,并且为是例如2-、3-或4-吡啶基甲基、1-或2-吡咯基甲基、1-吡唑基甲基、1-咪唑基甲基、2-(1-咪唑基)乙基或3-(1-咪唑基)丙基。

在取代的氨基中,取代基优选为如上文所提到的那些取代基。特别是,取代的氨基为烷基氨基、二烷基氨基、任选取代的芳基氨基、任选取代的芳烷基氨基、低级烷基羰基氨基、苯甲酰基氨基、吡啶基羰基氨基、低级烷氧基羰基氨基或任选取代的氨基羰基氨基。

考虑的特定盐是替换硫酸基团和羧酸官能团中的氢原子的那些。适合的阳离子为例如钠、钾、钙、镁或铵阳离子,或由含有例如低级烷基、羟基-低级烷基或羟基-低级烷氧基-低级烷基的伯、仲或叔胺质子化衍生的阳离子,例如,2-羟基乙基铵、2-(2-羟基-乙氧基)乙基二甲基铵、二乙基铵、二(2-羟基乙基)铵、三甲基铵、三乙基铵、2-羟基乙基二甲基铵或二(2-羟基乙基)甲基铵,以及由相应的取代的环状仲胺和叔胺质子化衍生的阳离子,例如N-甲基吡咯烷鎓、N-甲基哌啶鎓、N-甲基吗啉鎓、N-2-羟基乙基吡咯烷鎓、N-2-羟基乙基哌啶鎓或N-2-羟基乙基吗啉鎓等。

鉴于游离形式和盐形式的新化合物之间的紧密关系,盐形式包括可以用作中间体的那些盐,例如用于新化合物的纯化或鉴定,上下文提及的任何游离化合物应理解为还指相应的盐,反之亦然,视适当和方便情况而定。

优选地,Z为未取代的或取代的苯基。

特别是,本发明涉及式(I)或式(II)的化合物,其中Z为任选取代的苯基。

对于Z为提到的芳基(例如苯基)的含义,所考虑的优选取代基为:低级烷基,卤代-低级烷基,羟基-低级烷基,低级烷氧基-低级烷基,氨基-低级烷基,低级链烷基羰基氨基-低级烷基,巯基-低级链烷基-羰基氨基-低级烷基,任选取代的烯基,任选取代的炔基,环己基,环丙基,芳基,杂芳基,杂环基,羟基,低级烷氧基,卤代-低级烷氧基,低级烷氧基-低级烷氧基,环烷基氧基,羟基磺酰氧基;巯基,烷基巯基,羟基亚磺酰基,烷基亚磺酰基,卤代-低级烷基亚磺酰基,羟基磺酰基,烷基磺酰基,芳基磺酰基,杂芳基磺酰基,氨基磺酰基,其中氨基是未取代的或者被一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、任选取代的苯基-低级烷基和任选取代的杂芳基-低级烷基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;氨基,其任选地被一个或两个选自低级烷基、环烷基-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基和二-低级烷基氨基-低级烷基的取代基取代,或被一个选自环烷基、任选取代的苯基、任选取代的杂芳基、烷基羰基、任选取代的苯基羰基、任选取代的吡啶基羰基、烷氧基羰基或氨基羰基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;在甲基处取代的羧甲基氨基或低级烷氧基羰基-甲基氨基,使得所得的取代基对应于20种天然存在的标准氨基酸之一,在甲基处取代的氨基甲基-羰基氨基,使得所得的酰基对应于20种天然存在的标准氨基酸之一;低级烷基羰基,卤代-低级烷基羰基,羧基,低级烷氧基羰基,低级烷氧基-低级烷氧基羰基;氨基羰基,其中氨基是未取代的或者被一个羟基或氨基取代或者被一个或两个选自低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、任选取代的苯基-低级烷基和任选取代的杂芳基-低级烷基的取代基取代,或者其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基;氰基,卤素,和硝基;并且其中彼此邻位的两个取代基可以形成含有一个或两个氧原子和/或一个或两个氮原子的5或6元杂环,其中氮原子任选地被低级烷基、低级烷氧基-低级烷基或低级烷基羰基取代。

Z特别优选为对甲氧基苯基、4-(2-氨基乙基)苯基或4-(2-(4-巯基-丁酰基氨基)乙基)苯基。

在包含多个式(I)和/或式(II)取代基的聚合物中,特定的连接基团Z是(双官能)芳基、杂芳基、芳基-低级烷基、芳基羰基或杂芳基甲基,其中芳基或杂芳基被–(CH2)2NH(C=O)(CH2)3S-CH2-(C=O)-取代,其连接至具有氨基烷基侧链的聚合物的C=O官能团处。

更特别的是,连接基团Z为被–(CH2)2NH(C=O)(CH2)3S-CH2-(C=O)-取代的苯基,其连接至具有氨基烷基侧链的聚合物的C=O官能团处。

在包含式(I)和/或式(II)的多个取代基的聚合物中,优选的聚合物为聚赖氨酸,特别是聚-L-赖氨酸。

优选的聚赖氨酸的分子量为1000至300000kD,优选10000至100000kD。特别优选的分子量为约50000kD、125000kD或200000kD。最优选的分子量为约50000kD。

特别是,本发明涉及这样的聚合物,其中聚合物主链对式(I)的和/或(II)的二糖的相对载量为10%-80%,这意味着聚合物中所有赖氨酸侧链的10-80%与携带有二糖的连接基团偶联/反应,其余的氨基官能团被封端。聚合物的载量优选为30-60%,更优选40-50%。

在一个具体的实施方案中,合成携带具有末端巯基官能团的连接基团的硫酸化最小HNK-1表位22,并以亚化学计量量与活化(氯乙酰化)赖氨酸聚合物24反应。经1H NMR确定碳水化合物载量(40%)。起始聚合物23的平均分子量(MW)为50kD,而具有40%最小HNK-1表位载量的最终聚合物(25)的计算平均MW为123kD。

用已建立的酶联免疫吸附测定法(Bühlmann Laboratories,瑞士)测试合成的碳水化合物单体(1和2)和聚合物25,用于诊断抗-MAG神经病变以及用于临床中的治疗控制。该测定法用于测定抗-MAG IgM抗体的血清浓度。该测定法被修改为竞争性结合测定。将含有抗-MAG IgM抗体的合成的化合物和血清样品给予到96孔板,其涂覆有来自人脑的纯化的MAG。固定的MAG和合成的化合物竞争结合抗-MAG IgM抗体。洗涤步骤后,用辣根过氧化物酶标记的抗体检测MAG结合的IgM抗体,随后是比色反应。化合物与MAG的成功竞争导致测量的OD450nm(光密度)的下降,因为它们阻断了IgM抗体的结合位点,阻止它们结合到MAG。该测定法的原理在图1中描绘。为了评价化合物,选择来自不同患者(MK,DP,KH,SJ)的被报道具有高抗-MAG IgM抗体效价的四种血清。在初步实验中确定每种血清的IgM抗体浓度。选择具有测量的OD450nm值为约1.0的血清稀释液用于该测定,以能够比较抗体浓度依赖的测量的IC50值(半数最大抑制浓度)。血清稀释:DP 1:2500,KH 1:3000,SJ 1:7500,MK 1:23000。作为阴性对照(稀释1:1000)的两种血清液显示未结合MAG。

测定化合物1对所有的血清的IC50值。测定化合物2对与化合物1具有最高抗体亲和力的血清MK的IC50值,测定化合物2对与化合物1具有最低抗体亲和力的血清SJ的IC50值。结果显示于下表中。重复该测定四次。从所接收到的每个血清的结合曲线,选择三个最佳拟合曲线并归一化用于IC50计算。结合曲线示于图2。为了生成化合物2的曲线,加入了在500mM时为0%抗体结合的人为高浓度点,这是因为即使在化合物2的最高浓度(50mM),抗体结合的抑制也不是100%。因此化合物2的IC50值被认为是近似值,尽管它们在加入高浓度点处的改变很小。在相同的测定条件下用血清KH、MK和SJ测试碳水化合物聚合物。重复该测试至少三次。选择每种血清的三个最佳拟合曲线用于IC50计算。非归一化的结合曲线示于图2。

表:化合物1、2和最小HNK-1聚合物(25)对四种患者血清的IC50值,其包括标准偏差。

1和2的生物学评估数据清楚地表明各血清的IgM抗体对合成的二糖的不同亲和力。相比于缺乏硫酸部分的二糖2,二糖1显示了对于IgM抗体优异的结合亲和力。硫酸基团对于用于抗体结合的合成的最小HNK-1表位似乎至关重要。然而,它对所有的血清并非同样重要。血清MK表现出对硫酸的高要求,即对于未硫酸化的二糖弱约230倍的结合。另一方面血清SJ表现出对于未硫酸化的二糖低仅12.6倍的结合亲和力。GlcA的羧基似乎对于这种血清更重要。

对于所有的IgM抗体,需要在μM范围内结合的硫酸部分。令人惊奇的是,硫酸化最小HNK-1表位能够抑制抗体在μM浓度范围结合MAG。这表明二糖的末端芳族部分参与结合的可能性,犹如模仿HNK-1表位的第三个糖(GlcNAc)。该芳族环可以经历阳离子π相互作用或π-π堆叠。

目前抗-MAG神经病变患者中抗-MAG自身抗体和神经病变发展之间的因果关系已广为接受(M.C.Dalakas,Current Treatment Options in Neurology 2010,12:71–83)。这些抗体的抗原决定簇是HNK-1碳水化合物表位,三糖SO4-3-GlcA(β1-3)Gal(β1-4)GlcNAc-OH也被HNK-1抗体识别。

根据本发明表明,阻断IgM抗体结合位点的碳水化合物配体阻止抗体结合MAG和其它髓鞘靶标。

已示出式(I)和(II)的二糖配体,相比更大的碳水化合物,非常容易制备的最小HNK-1的碳水化合物表位保留了对IgM抗体的亲和力并用于诊断和治疗目的。

现有技术中与物质1和2相关的化合物是已知的,但不知晓含有丙烯酸糖苷配基的化合物。芳香族残基参与对抗-MAG IgM抗体的结合过程,因此赋予例如具有丙烯酸糖苷配基的式(I)和/或(II)的化合物以实质性益处。

有关硫酸化结构(I),公开的有五糖的乙胺取代衍生物(A.V.Kornilov,Carbohydrate Research 2000,329:717-730)。有关结构(II),公开的有未取代的衍生物(R=H)和具有常见烷基残基的衍生物。除了目前要求保护的芳基取代,如对甲氧基苯基,以多个拷贝将该表位呈递在适合的聚合物上的方法是新颖的。

天然碳水化合物通常显示对其结合搭配物的低结合亲和力。在生物系统中,足够的亲和力通常是由碳水化合物的多价呈现以及碳水化合物结合蛋白的碳水化合物识别域(CRD)的低价呈现来实现(B.Ernst and J.L.Magnani,Nature Reviews Drug Discovery 2009,8:661-677)。这也是IgM抗体结合MAG的情况:MAG在其胞外结构域上呈现高达8个HNK-1表位。

在一个特别优选的实施方案中,本发明涉及包含(I)和/或式(II)的多个取代基的聚合物,其中聚合物是聚-L-赖氨酸,Z是连接所述取代基至聚合物主链的双官能连接基团。

聚-L-赖氨酸是可生物降解的,因此适合于治疗应用。例举的最小HNK-1聚合物显示出对致病IgM抗体的结合亲和力的显著增加。在低nM范围内的抑制活性相对于单体(血清KH)增加了至少34'000。对于血清MK和SJ,得到的亲和力增加为约50'000(见上表)。这些结果清楚地表明抗原-抗体相互作用的多价性质。

例举的最小HNK-1聚合物用作目前用于抗-MAG IgM抗体检测的诊断ELISA试验中的纯化的人脑MAG的替代抗原。

本发明的化合物具有有价值的药理学性质。本发明还涉及如上文所限定的化合物用作药物。根据本发明的化合物显示了预防和治疗功效尤其是针对抗-MAG神经病变。

式(I)或(II)的化合物或包含这些的聚合物可以单独施用或与一种或多种其它治疗剂组合施用,可能的联合治疗采取固定组合的形式,或本发明化合物和一种或多种其它治疗剂被交错或相互独立地施用,或固定组合和一种或多种其它治疗剂的联合施用。

用于可能组合的治疗剂尤其为免疫抑制剂。实例是嘌呤类似物如氟达拉滨和/或克拉屈滨,此外还有嵌合单克隆抗体利妥昔单抗(A.J.Steck et al.,Current Opinion in Neurology 2006,19:458-463)。

在另一个具体实施方案中,本发明涉及本发明的化合物在抗-MAG神经病变诊断测定中的应用。特别是,本发明涉及包含如上所定义的式(I)或(II)的化合物的试剂盒,以及包含作为取代基的这类化合物的本发明的聚合物。

本发明涉及诊断抗-MAG神经病变的方法,其中确定体液样品例如血清中抗MAG的IgM水平,高水平指示抗-MAG神经病变的发展和严重性。

用于测定抗MAG的IgM的血清外的其他体液是例如全血、脑脊髓液或固体组织的提取物。

任何已知的方法可以用于测定体液中抗MAG的IgM水平。考虑的方法是例如ELISA、RIA、EIA或微阵列分析。

测定人体体液例如血清中抗MAG的IgM的优选方法是ELISA。在这种实施方案中,微量滴定板涂覆有式(I)或(II)的化合物,或者优选包含作为取代基的这类化合物的本发明的聚合物。然后封阻该板并加载样品或标准溶液。温育后,应用抗-IgM抗体,例如直接与合适的标记物,例如与用于生色检测的酶缀合的抗-IgM抗体。可选地,添加多克隆兔(或小鼠)抗-IgM抗体。然后加入检测特定类型的抗-IgM抗体例如抗兔(或抗小鼠)抗体(其与合适的标记物例如用于生色检测的酶缀合)的第二抗体。

最后将板用标记物的底物显影,以便检测和量化标记物,其是对抗MAG的IgM的存在和量的检测。如果标记物是用于生色检测的酶,则底物是缀合酶的生色底物。然后用酶标仪检测生色反应并与标准比较。

也可以使用抗体片段。适合的标记物是生色标记物,即可用于将底物转化为可检测的有色或荧光化合物的酶,光谱标记物,例如荧光标记物或呈现可见颜色的标记物,亲和标记物,其可被对该标记物具有特异性的另一化合物显色并允许容易地检测和量化,或者用于标准ELISA的任何其他标记物。

抗MAG的IgM检测的其他优选方法是放射免疫测定法或竞争性免疫测定法和在商用自动化分析机器人上的化学发光检测。也可使用微粒增强荧光、荧光偏振方法或质谱法。检测装置例如微阵列是有用的部件,作为抗MAG的IgM的读出系统。

在另一实施方案中,本发明涉及适合于如上所述测定特别是ELISA方法的试剂盒,其包括式(I)或(II)的化合物,或者包含作为取代基的这类化合物的聚合物。

该试剂盒还包含携带合适的标记物的抗-IgM抗体(或抗-IgM抗体片段),或抗IgM抗体和携带这种合适的标记物的第二抗体,以及检测该标记物的试剂或设备,例如与用作标记物的酶反应并通过颜色形成或荧光指示标记物的存在的试剂,标准设备如微量滴定板、吸液管等,标准溶液和洗涤溶液。

ELISA法也可以这样的方式设计,即该患者的血液或血清样品用于微量滴定板的涂覆以及随后用具有式(I)或(II)的标记化合物或者包含作为取代基的这类化合物的标记聚合物对抗-MAG抗体进行检测。标记物可以通过抗体直接检测或间接检测。

本发明的携带式(I)或(II)的化合物的聚合物结合到致病抗-MAG IgM抗体并可能下调抗-MAG的IgM抗体的生成。这允许对抗-MAG神经病变患者的抗原特异性治疗。

此外,本发明涉及包括式(I)或(II)的化合物,或携带本发明式(I)或(II)的化合物的聚合物的药物组合物。

考虑用于肠胃外给药(例如皮下、静脉内、肝内或肌内给药)至温血动物(尤其是人)的药物组合物。该组合物包含单独的活性成分,或优选与药学上可接受的载体一起。活性成分的剂量取决于患者的年龄、体重和个体情况、个体药动学数据和给药方式。

对于肠胃外给药,优选使用本发明的碳水化合物聚合物的悬浮剂或分散剂,尤其是可在使用前即刻制备的等渗水分散液或悬浮液。该药物组合物可以被灭菌和/或可包含赋形剂,例如防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、增粘剂和用于调节渗透压的盐和/或缓冲液,其以公知的方式例如通过常规溶解和解冻处理的手段制备。

用于经肠给药如经鼻、经颊、直肠或口服给药的适合的载体尤其为填充剂,如糖,例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇,纤维素制剂和/或磷酸钙,例如磷酸三钙或磷酸氢钙,以及粘合剂,如淀粉,例如玉米、小麦、大米或马铃薯淀粉、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮,和/或崩解剂(如果需要的话),如上述的淀粉、羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸或其盐,如藻酸钠。另外的赋形剂尤其为流动调节剂和润滑剂,例如硅酸、滑石粉、硬脂酸或其盐,如硬脂酸镁或硬脂酸钙,和/或聚乙二醇,或其衍生物。

片芯可以提供有适合的任选的肠溶包衣,其通过使用特别是在适合的有机溶剂或溶剂混合物中的浓缩糖溶液或者包衣溶液而提供,该糖溶液可以包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛,或者用于制备肠溶包衣、适合的纤维素制剂溶液如乙酰纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯。可以将染料或色素加入到片剂或片剂包衣中,例如用于标识目的或指示活性成分的不同剂量。

用于口服给药的药物组合物还包括由明胶组成的硬胶囊,以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇组成的软密封胶囊。硬胶囊可以含有颗粒形式的活性成分,例如以与填充剂如玉米淀粉、粘合剂和/或助流剂如滑石粉或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的形式。在软胶囊中,活性成分优选溶解或悬浮在适合的液体赋形剂如脂肪油、石蜡油或液体聚乙二醇或者乙二醇或丙二醇的脂肪酸酯中,向其中也可以加入例如聚甲醛-乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类的稳定剂和洗涤剂。

适于直肠给药的药物组合物是例如由活性成分和栓剂基质的组合组成的栓剂。适合的栓剂基质是例如天然或合成的甘油三酯、石蜡烃、聚乙二醇或高级链烷醇。

根据本发明所提到的药物组合物可含有单独的片剂、颗粒或其它形式的可口服接受的活性成分的制剂,或可以在一个合适的药物剂形中包含活性成分的混合物,如上所述。特别是,单独的口服可接受的制剂或在一个合适的药物剂型中的混合物可以是缓释和控释的药物组合物。

该药物组合物包含从约1%至约95%的活性成分或活性成分的混合物,在优选实施方案中单剂量给药形式包含约20%至约90%的活性成分,在优选实施方案中非单剂量型的形式包含约5%至约20%的活性成分。

本发明还涉及所提到的药物组合物作为抗-MAG神经病变的治疗药物。

本发明还涉及治疗抗-MAG神经病变的方法,其包括将本发明的组合物以对该疾病的有效量施用至需要这种治疗的温血动物。该药物组合物可以被预防或治疗性地施用,优选以对该疾病有效的量施用至需要这种治疗的温血动物,例如人。对于体重约70千克的个体,施用的日剂量是本发明的组合物中约0.01克至约5克、优选约0.25克至约1.5克的活性成分。

仅出于举例的目的,本发明包括但不限于如下的技术方案:

技术方案1.式(I)或式(II)的化合物,

其中Z是任选地取代的苯基、杂芳基、芳基羰基或杂芳基甲基。

技术方案2.根据技术方案1所述的式(I)或式(II)的化合物,其中Z是未取代的或取代的苯基。

技术方案3.根据技术方案2所述的式(I)或式(II)的化合物,其中Z是对甲氧基苯基。

技术方案4.根据技术方案2所述的式(I)的化合物,其中Z是对甲氧基苯基。

技术方案5.根据技术方案2所述的式(II)的化合物,其中Z是对甲氧基苯基。

技术方案6.聚合物,其包含多个式(I)和/或式(II)取代基,

其中Z是将所述取代基连接至聚合物主链的连接基团。

技术方案7.根据技术方案6所述的聚合物,其中所述聚合物主链为α-氨基酸聚合物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或共聚物,或N-乙烯基-2-吡咯烷酮-乙烯醇共聚物。

技术方案8.根据技术方案6所述的聚合物,其中所述聚合物主链为α-氨基酸聚合物,其中所述α-氨基酸为赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。

技术方案9.根据技术方案6所述的聚合物,其中所述聚合物主链为聚赖氨酸。

技术方案10.根据技术方案7所述的聚合物,其中所述聚合物主链的分子量为1000kD至300000kD。

技术方案11.根据技术方案6-10中任一项所述的聚合物,其中所述连接基团Z是芳基、杂芳基、芳基-低级烷基、芳基羰基或杂芳基甲基,其中芳基或杂芳基被连接至所述聚合物的具有3至25个碳原子的亚烷基取代,

其中任选地:

(a)亚烷基的一个或多个碳原子被携带氢原子的氮替换,并且相邻碳原子中的一个被氧代取代,表示为酰胺官能团-NH-CO-;和/或

(b)亚烷基中的一个或多个碳原子被氧替换;

(c)亚烷基的一个或多个碳原子被硫替换;和/或

(d1)连接至所述聚合物的末端碳原子被氧代取代;或者

(d2)连接至所述聚合物的末端碳原子被-NH-替换。

技术方案12.根据技术方案6-11中任一项所述的聚合物,其中所述聚合物主链相对于式(I)和/或式(II)的二糖的相对分子量为10:1至1:1.5。

技术方案13.药物组合物,其包含技术方案1-5中任一项所述的式(I)或式(II)的化合物或者技术方案6-12中任一项所述的聚合物。

技术方案14.诊断试剂盒,其包含技术方案1-5中任一项所述的式(I)或式(II)的化合物或者技术方案6-12中任一项所述的聚合物。

技术方案15.技术方案1-5中任一项所述的式(I)或式(II)的化合物或者技术方案6-12中任一项所述的聚合物在诊断抗-MAG神经病变中的应用。

技术方案16.治疗抗-MAG神经病变的方法,其包括:将技术方案1-5中任一项所述的式(I)或式(II)的化合物或者技术方案6-12中任一项所述的聚合物以对所述神经病变有效的量施用至需要这种治疗的温血动物。

以下实施例用于说明本发明而并非对发明的范围进行限制。

实施例

一般方法

用Bruker Avance DMX-500(500兆赫兹)光谱仪获得NMR光谱。用2D方法(COSY和HSQC)获得1H和13C NMR光谱的归属。使用残留的CHCl3、CHD2OD或HDO作为参考以ppm表示化学位移。用Perkin-Elmer旋光仪341测量旋光度。使用Perkin-Elmer Spectrum One FT-IR光谱仪记录IR光谱。用Waters micromass ZQ得到电喷雾电离质谱(ESI-MS)。HRMS分析使用配备有光电二极管阵列检测器的Agilent 1100LC和配备有4GHz数字-时间转换器的Micromass QTOF进行。反应通过使用涂有硅胶60F254(Merck)的玻璃板的TLC监测,并通过使用UV光和/或通过用mostain(0.02M二水合硫酸铵铈溶液和10%四水合钼酸铵的H2SO4水溶液)炭化来显现。在硅胶上(Fluka C60 40/60)或RP-18(Merck RP-18 40/60)进行柱色谱法。通过用甲醇钠回流和蒸馏来干燥甲醇(MeOH)。用活化的分子筛干燥吡啶。自Acros购买二甲基甲酰胺(DMF)(99.8%,额外干燥,用分子筛)。二氯甲烷(DCM)、甲苯和己烷通过用Al2O3(Fluka,型号5016A碱性)过滤来干燥。即将使用前,将分子筛在真空中500℃下活化1小时。用Eppendorf离心机5804R在室温下离心。

根据方案1和2合成用于生物学评价的三个化合物(1、2和25)。从Sigma Aldrich或Acros购买所有试剂。通过使活化的GlcA供体3(C.Coutant and J.-C.Jacquinet,J Chem Soc Perkin Trans I,1995,1573-1581)和选择性保护的Gal受体4(F.Belot et al.,Synlett 2003,1315-1318)与作为催化剂的三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐(TMSOTf)反应获得GlcA-Gal二糖5。在四氢呋喃(THF)/水(H2O)中用LiOH对酯基团脱保护得到6。通过催化氢化得到二糖2。通过由A.V.Kornilov(Carbohydrate Research 2000,329:717-730)公布的内酯化/甲醇分解步骤合成3'-未保护的二糖7。随后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的硫酸-吡啶复合物(SO3·Py)硫酸化,得到3-O-硫酸化的二糖8(65%)。最后通过催化氢化脱保护接着用Na+阳离子交换树脂水解和处理得到希望的硫酸化二糖1。

为了合成碳水化合物聚合物25,制备硫酸化单体21(方案1)。它含有4-(2-氨基乙基)苯基糖苷配基,代替1中存在的对-甲氧基苯基。偶联到聚赖氨酸聚合物需要额外的伯氨基。为了合成它,用三氯亚氨逐乙酸酯供体10使4-(2-叠氮基乙基)苯酚(9)半乳糖化(R.Burkowski et al.,Eur J Org Chem 2001,2697-2705)。受体9是由胺-叠氮化物从酪氨酸相互转化而获得(A.Titz et al.,Tet.Letters 2006,47:2383-2385)。在Zempén条件下的脱乙酰化(得到12),接着是3,4-异亚丙基衍生物13的形成,二苄化作用(得到14),缩丙酮的酸催化裂解(得到15)和单苯甲酰化得到半乳糖苷16。对于直至单硫酸化的二糖21的其余步骤,应用如同已经用于合成二糖1的类似反应顺序,除了使用50%NaOH水溶液/DCM和18-冠-6醚的相转移催化下进行的苄基化。21中的游离氨基然后与DMF中的硫代丁内酯和三乙胺(TEA)反应,得到产率为59%的化合物22,备用于偶联到聚赖氨酸聚合物。

为了这个目的,使商购聚赖氨酸聚合物23酰化,得到产率为96%的24(G.Thoma et al.,J Am Chem Soc 1999,121:5919-5929),随后将其偶联到亚化学计量量的最小HNK-1表位22(0.4当量)。为了提高糖基化聚赖氨酸聚合物的水溶解度,用过量的硫代甘油对剩余的氯乙酰胺基团进行封端。通过超滤纯化(Sartorius Stedim Vivaspin 6,molecular weight cutoff,5000)得到产率为70%的含糖聚合物25。

方案1:硫酸化(1)和未硫酸化形式(2)的最小HNK-1表位的合成

试剂和条件:a)TMSOTf,分子筛DCM,0℃至室温,(81%),b)LiOH,THF/H2O(97%);c)Pd(OH)2/C,H2,MeOH/H2O(96%);D)Ac2O,80℃,吡啶,DMAP;MeOH,无水AcONa(57%);e)SO3·Py,DMF(65%);f)Pd(OH)2/C,H2,MeOH/H2O,LiOH,MeOH/H2O(88%)。

4-甲氧基苯基(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸甲酯)-(1→3)-4-O-苯甲酰基-2,6-二-O-苄基-β-D-半乳酸吡喃糖苷(5)

在氩气3下(1.12g,1.68mmol),将化合物4a(800mg,1.40mmol)和活化的分子筛(1.2g)悬浮在DCM(30mL)中。将混合物在室温下搅拌1小时,然后冷却至0℃。逐滴加入TMSOTf(38.1μL,0.21mmol)。使反应混合物温热至室温过夜,然后用TEA(100μL)中和并浓缩。将残余物通过色谱法(石油醚/EtOAc,9:1至7:3)纯化,得到为白色固体的化合物5(1.21g,1.13mmol,81%)。

[α]D20+28.4(c 1.01,CHCl3);1H NMR(500MHz,CDCl3):δ3.59(dd,J=7.2,10.1Hz,1H,H-6a),3.65(s,3H,OMe),3.69(dd,J=4.8,10.1Hz,1H,H-6b),3.74(s,3H,OMe),3.93(dd,J=7.8,9.5Hz,1H,H-2),3.96(dd,J=5.1,6.9Hz,1H,H-5),4.12(d,J=9.8Hz,1H,H-5’),4.20(dd,J=3.5,9.6Hz,1H,H-3),4.46(AB的A,B,J=11.5Hz,2H,CH2Ph),4.51,4.90(AB的A,B,J=10.5Hz,2H,CH2Ph),4.94(d,J=7.8Hz,1H,H-1),5.36(d,J=7.5Hz,1H,H-1’),5.44(dd,J=7.5,9.2Hz,1H,H-2’),5.66(t,J=9.6Hz,1H,H-4),5.72-5.79(m,2H,H-3’,H-4’),6.76,7.00(AA’BB’的AA’,BB’,J=9.1Hz,4H,C6H4),7.19-7.44,7.47-7.51,7.54-7.61,7.75-7.78,7.87-7.91,8.03-8.08(m,30H,6C6H5);13C NMR(126MHz,CDCl3):δ52.88,55.64(2OMe),69.07(C-6),70.01(C-4),70.05(C-4’),71.76(C-2’),72.17(C-3’),72.90(C-5’),73.54(C-5),73.72,75.23(2CH2Ph),76.16(C-3),79.86(C-2),100.29(C-1’),102.73(C-1),114.57,118.19(4C,C6H4),127.69,127.78,128.00,128.09,128.30,128.37,128.43,128.59,128.71,128.89,129.05,129.58,129.77,129.82,129.92,130.11,132.91,133.08,133.27,133.39,137.88,137.90(36C,6C6H5),151.33,155.33(2C,C6H4),164.45,165.00,165.52,165.63,167.15(5CO);ESI-MS:m/z:计算值C62H56NaO17[M+Na]+:1095.35,实测值:1095.48.

4-甲氧基苯基(β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸盐)-(1→3)-2,6-二-O-苄基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(6)

将化合物5(810mg,0.76mmol)悬浮于THF(7mL)中,将悬浮液冷却至-10℃。然后逐滴加入2M LiOH水溶液(5mL)。将反应混合物搅拌过夜并温热至室温。蒸发溶剂,将残余物溶于THF/H2O(2:3,8mL)中,用TFA(4mL)处理30分钟。将混合物蒸发至干燥,残余物通过反相色谱法(RP-18,MeOH/水,0:1至2:1)纯化,得到为白色固体的6(0.47g,0.73mmol,97%)。

[α]D20-43.2(c 1.00,MeOH);1H NMR(500MHz,CD3OD):δ3.30-3.41(m,2H,H-2’,H-3’),3.49(t,J=8.9Hz,1H,H-4’),3.66(s,3H,OMe),3.68(d,J=5.9Hz,2H,H-6a,H-6b),3.72(d,J=9.7Hz,1H,H-5’),3.76(d,J=5.9Hz,1H,H-5),3.79(dd,J=3.3,9.9Hz,1H,H-3),3.87(m,1H,H-2),4.00(d,J=2.7Hz,1H,H-4),4.48(s,2H,CH2Ph),4.70(d,J=7.4Hz,1H,H-1’),4.84(d,J=7.7Hz,1H,H-1),4.87(s,2H,CH2Ph),6.73,6.97(AA’BB’的AA’,BB’,J=9.0Hz,4H,C6H4),7.17-7.28(m,8H,2C6H5),7.38(d,J=7.1Hz,2H,2C6H5);13C NMR(126MHz,CD3OD):δ56.10(OMe),70.37(C-4),70.72(C-6),73.35(C-4’),74.37(CH2Ph),74.85(C-2’),75.00(C-5),76.22(C-5’),76.46(CH2Ph),77.35(C-3’),80.11(C-2),82.20(C-3),103.87(C-1),105.59(C-1’),115.58,119.23(4C,C6H4),128.66,128.76,128.79,129.31,129.41,129.77,139.76,139.96(12C,2C6H5),153.05,156.67(2C,C6H4),173.01(CO);ESI-MS:m/z:计算值C33H38NaO13[M+Na]+:665.23,实测值:665.23.

4-甲氧基苯基(β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸钠)-(1→3)-β-D-半乳糖吡喃糖苷(2)

在氩气下将化合物6(205mg,0.31mmol)和Pd(OH)2/C(42mg,20%)悬浮在MeOH/H2O(10:1,5mL)中。将该混合物在氢气(1个大气压)气氛下搅拌过夜,然后通过硅藻土垫过滤催化剂。用MeOH/H2O梯度(6×10mL,10:0,8:2,6:4,4:6,2:8,0:10)洗涤硅藻土。将滤液浓缩并通过50X8(Na+)离子交换柱。浓缩后,将残余物通过反相色谱法(RP-18,水)以及随后的P2尺寸排阻层析纯化,得到为白色固体的化合物2(148mg,0.31mmol,96%)。

[α]D20-40.7(c 1.00,H2O);1H NMR(500MHz,D2O):δ3.43(t,J=8.3Hz,1H,H-2’),3.48-3.56(m,2H,H-3’,H-5’),3.67-3.81(m,7H,H-5,H-6,H-4’,OMe),3.83(dd,J=2.9,9.8Hz,1H,H-3),3.90(dd,J=8.0Hz,1H,H-2),4.22(d,J=2.5Hz,1H,H-4),4.68(d,J=7.7Hz,1H,H-1’),4.95(d,J=7.9Hz,1H,H-1),6.94,7.09(AA’BB’的AA’,BB’,J=9.0Hz,4H,C6H4);13C NMR(126MHz,D2O):δ55.71(OMe),60.70(C-6),67.94(C-4),69.63(C-2),71.73(C-3’),73.09(C-2’),75.05(C-5’),75.25(C-5),76.18(C-4’),82.37(C-3),101.29(C-1),103.61(C-1’),114.96,118.10,150.84,154.61(6C,C6H4),175.92(CO);HRMS:m/z:计算值C19H26NaO13[M+H]+:485.1271,实测值:485.1276.

4-甲氧基苯基(2,4-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸甲酯)-(1→3)-4-O-乙酰基-2,6-二-O-苄基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(7)

在80℃下将6(470mg,0.73mmol)在Ac2O(10mL)中的溶液搅拌90分钟,然后冷却至室温。加入吡啶(6mL)和DMAP(15mg)并将反应混合物搅拌3天。将溶剂与甲苯(5×5mL)共蒸发。将残余物溶解在DCM(50mL)中,用盐水(50mL)和水(50mL)萃取。将有机相经硫酸钠干燥,并通过脱脂棉过滤。在溶剂蒸发后,将残余物溶于无水MeOH(14mL)并加入无水醋酸钠(90mg)。将混合物搅拌过夜,用15(H+)离子交换树脂中和并过滤。浓缩滤液并通过快速色谱法(石油醚/EtOAc,2:1~1:1)纯化残余物,得到为浅黄色固体的化合物7(334mg,0.43mmol,57%)。

[α]D20+34.3(c 1.00,CHCl3);1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.92,2.01,2.04(3s,9H,3OAc),3.48(dd,J=7.1,10.1Hz,1H,H-6a),3.55(dd,J=4.8,10.1Hz,1H,H-6b),3.60(m,1H,H-3’),3.66,3.69(2s,6H,2OMe),3.77(dd,J=5.4,7.0Hz,1H,H-5),3.80(d,J=9.8Hz,1H,H-5’),3.83(dd,J=7.6,9.7Hz,1H,H-2),3.89(dd,J=3.5,9.7Hz,1H,H-3),4.43(AB的A,B,J=11.6Hz,2H,CH2Ph),4.64(AB的A,J=11.5Hz,1H,CH2Ph),4.81(d,J=7.6Hz,1H,H-1),4.83-4.87(m,H-1’,H-2’),4.97(AB的B,J=11.5Hz,1H,CH2Ph),5.06(t,J=9.5Hz,1H,H-4’),5.36(d,J=3.2Hz,1H,H-4),6.72,6.96(AA’BB’的AA’,BB’,J=9.1Hz,4H,C6H4),7.18-7.31(m,10H,2C6H5);13C NMR(126MHz,CDCl3):δ20.72,20.76,20.80(3COCH3),52.81,55.63(2OMe),68.95(C-6),69.33(C-4),71.87(C-4’),72.54(C-5),73.04(C-5’),73.26(C-3’),73.70(CH2Ph),73.79(C-2’),75.31(CH2Ph),77.24(C-3),79.26(C-2),100.15(C-1’),102.65(C-1),114.56,118.24(4C,C6H4),127.76,127.83,127.98,128.04,128.41,128.53,137.87,138.00(12C,2C6H5),151.35,155.35(2C,C6H4),167.46,170.15,170.36,170.38(4CO);ESI-MS:m/z:计算值C40H46NaO16[M+Na]+:805.28,实测值:805.34.

4-甲氧基苯基(2,4-二-O-乙酰基-3-O-磺基-β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸甲酯)-(1→3)-4-O-乙酰基-2,6-二-O-苄基-β-D-半乳糖吡喃糖苷钠盐(8)

将化合物7(334mg,0.43mmol)溶于DMF(5mL)并加入SO3·Py(370mg,2.34mmol)。将该混合物在室温下搅拌2小时,然后用NaHCO3通过搅拌(320mg,3.77mmol)2小时淬灭反应。将固体滤出并用MeOH洗涤滤液。使滤液通过50X8(Na+)离子交换柱,浓缩,将残余物通过快速色谱法(DCM/MeOH,1:0至9:1)纯化,得到为浅黄色固体的8(237mg,0.28mmol,65%)。在快速色谱法后浓缩期间加入几滴0.1M的NaOH水溶液。

[α]D20-10.4(c 1.01,MeOH);1H NMR(500MHz,CD3OD):δ1.89,2.03,2.06(3s,9H,3OAc),3.48(dd,J=7.4,10.4Hz,1H,H-6a),3.59(dd,J=4.4,10.5Hz,1H,H-6b),3.69,3.72(2s,6H,2OMe),3.77(dd,J=7.8,9.6Hz,1H,H-2),3.98(dd,J=4.5,7.4Hz,1H,H-5),4.03(m,1H,H-3),4.05(d,J=10.2Hz,1H,H-5’),4.46,4.49(AB的A,B,J=11.6Hz,2H,CH2Ph),4.60(t,J=9.3Hz,1H,H-3’),4.73,4.92(AB的A,B,J=11.8Hz,2H,CH2Ph),4.94(d,J=7.5Hz,1H,H-2’),4.96(d,J=7.9Hz,1H,H-1’),4.99(d,J=8.0Hz,1H,H-1),5.06(m,1H,H-4’),5.40(d,J=3.6Hz,1H,H-4),6.77,7.00(AA’BB’的AA’,BB’,J=9.1Hz,4H,C6H4),7.23-7.35(m,8H,2C6H5),7.39(d,J=7.2Hz,2H,2C6H5);13C NMR(126MHz,CD3OD):δ19.32,19.23,19.64(3COCH3),51.68,54.52(2OMe),68.73(C-6),69.50(C-4),69.80(C-4’),71.36(C-2’),71.91(C-5’),72.52(C-5),72.83,74.69(2CH2Ph),77.50(C-3’),78.57(C-3),78.59(C-2),100.04(C-1),102.01(C-1’),114.03,117.64(4C,C6H4),127.14,127.23,127.36,127.57,127.81,127.89,138.02,138.23(12C,2C6H5),151.29,155.26(2C,C6H4),167.77,170.07,170.17,170.64(4CO);ESI-MS:m/z:计算值C40H46O19S[M]+:862.24,实测值:862.42.

4-甲氧基苯基(3-O-磺基-β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸二钠)-(1→3)-β-D-半乳糖吡喃糖苷(1)

在氩气下将化合物8(237mg,0.28mmol)和Pd(OH)2/C(48mg,20%)悬浮在MeOH/H2O(10:1,5mL)中。将反应混合物在氢气气氛下(1个大气压)搅拌9小时。将催化剂通过硅藻土垫过滤,并用MeOH/H2O梯度(6×10mL,10:0,8:2,6:4,4:6,2:8,0:10)洗涤该垫。浓缩滤液,将残余物溶解在MeOH/H2O(1:1,8mL)中。然后在-10℃下加入1M的LiOH(6.5mL),并将反应混合物温热至室温,历经3小时,用15(H+)离子交换树脂中和、过滤并浓缩。将残余物通过反相色谱法(RP-18,水)纯化,并通过50X8(Na+)离子交换柱。最后用P2尺寸排阻色谱法纯化,得到为固体的1(142mg,0.24mmol,88%)。

[α]D20-19.2(c 1.00,H2O);1H NMR(500MHz,D2O):δ3.63(dd,J=8.0,9.2Hz,1H,H-2’),3.73(m,1H,H-4’),3.75-3.81(m,6H,H-5,H-6,OMe),3.85(d,J=10.0Hz,1H,H-5’),3.89(dd,J=3.2,9.9Hz,1H,H-3),3.94(dd,J=7.7,9.8Hz,1H,H-2),4.24(d,J=3.1Hz,1H,H-4),4.40(t,J=9.2Hz,1H,H-3’),4.81(d,J=7.9Hz,1H,H-1’),4.97(d,J=7.7Hz,1H,H-1),6.96,7.11(AA’BB’的AA’,BB’,J=9.2Hz,4H,C6H4);13C NMR(126MHz,D2O):δ55.82(OMe),60.62(C-6),67.95(C-4),69.55(C-2),70.42(C-4’),71.86(C-2’),74.92(C-5),75.82(C-5’),82.49(C-3),83.30(C-3’),101.43(C-1),103.17(C-1’),115.02,118.14,150.89,154.59(6C,C6H4),175.48(CO);HRMS:m/z:计算值C19H25Na2O16S[M+H]+:587.0659,实测值:587.0665.

方案2:最小HNK-1聚合物25的合成

试剂和条件:a)TMSOTf,分子筛DCM,0℃至室温(53%);b)MeOH,NaOMe,室温,过夜(得到12,95%);c)2,2-二甲氧基丙烷,对-TsOH(Ts:甲苯酰基磺酰基),DMF,室温,过夜(75%);d)冠醚15-冠-5,BnBr,50%的NaOH水溶液,DCM,过夜,60℃(83%);e)AcOH,H2O,60℃,过夜(定量);f)原苯甲酸三甲酯,对-TsOH,甲苯,45℃,过夜;AcOH,H2O,60℃,2小时(93%);g)TMSOTf,分子筛DCM,0℃至室温,86%;h)在THF/H2O中的LiOH(89%);i)Ac2O,DMAP,吡啶;MeOH,NaOAc MeOH(得到18,73%);j)SO3·Py,DMF(91%);k)LiOH,THF/H2O;Pd(OH)2/C,H2,MeOH/H2O(78%);l)二硫苏糖醇,硫代丁内酯,TEA,DMF,85℃(59%);m)氯乙酸酐,2,6-二甲基吡啶,DMF(96%);n)DMF,H2O,DBU;硫代甘油,TEA;超速离心(70%)。

4-(2-叠氮基乙基)苯酚(9)

将酪胺(3.43g,25.0mmol)、NaHCO3(7.80g,92.8mmol)和CuSO4·5H2O(0.22g,0.9mmol)溶解于水(30mL)中。根据Titz A.et al.,Tetrahedron Letters 47:2383-2385(2006)制备三氟甲磺酸叠氮化物储备溶液(40mL),加入MeOH(190mL)得到均匀的混合物。将混合物在室温下搅拌过夜,然后用水(150mL)稀释并用EtOAc(3×150mL)萃取。将有机层经硫酸钠干燥,并蒸发溶剂。将残余物通过快速色谱法(石油醚/EtOAc,1:0至4:1)纯化得到为无色油状物的化合物9(定量的)。

1H NMR(500MHz,CDCl3):δ2.81(t,J=7.3Hz,2H,CH2CH2N3),3.44(t,J=7.2Hz,2H,CH2CH2N3),6.77,7.07(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.5Hz,4H,C6H4);13C NMR(126MHz,CDCl3):δ34.50(CH2CH2N3),52.72(CH2CH2N3),115.53,129.96,130.22,154.39(6C,C6H4);IR(膜):2105cm-1(N3).

4-(2-叠氮基乙基)苯基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(11)

在氩气下向10(8.30g,17.5mmol)(Bukowski R et al.,European Journal of Organic Chemistry 2001:2697-2705)和分子筛(3g)在DCM(40mL)中的冰冷悬浮液中加入9(4.00g,24.5mmol)在DCM(40mL)中的溶液。逐滴加入TfOH(0.45mL,2.5mmol),并将反应混合物温热至室温过夜。用TEA(0.8mL)淬灭后,将悬浮液过滤并且将滤液浓缩。将残余物通过快速色谱法(石油醚/EtOAc,9:1至3:2)纯化,得到为油状物的11(4.58g,9.28mmol,53%)。

[α]D20+6.1(c 1.10,CHCl3);1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.98,2.02,2.06,2.15(4s,12H,4OAc),2.82(t,J=7.2Hz,2H,CH2CH2N3),3.45(t,J=7.1Hz,2H,CH2CH2N3),4.02(t,J=6.6Hz,1H,H-5),4.13(dd,J=6.3,11.3Hz,1H,H-6a),4.20(dd,J=6.9,11.2Hz,1H,H-6b),4.99(d,J=8.0Hz,1H,H-1),5.08(dd,J=3.4,10.5Hz,1H,H-3),5.40-5.48(m,2H,H-2,H-4),6.93,7.12(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.6Hz,4H,C6H4);13C NMR(126MHz,CDCl3):δ20.58,20.65,20.65,20.73(4COCH3),34.52(CH2CH2N3),52.51(CH2CH2N3),61.36(C-6),66.89(C-4),68.67(C-2),70.85(C-3),71.01(C-5),99.78(C-1),117.19,129.87,133.01,155.85(6C,C6H4),169.40,170.13,170.26,170.36(4CO);ESI-MS:m/z:计算值C22H27N3NaO10[M+Na]+:516.17,实测值:516.19;IR(膜):2101cm-1(N3).

4-(2-叠氮基乙基)苯基β-D-半乳糖吡喃糖苷(12)

在氩气下将化合物11(4.58g,9.28mmol)在MeOH(45mL)中的溶液用1M的NaOMe/MeOH(4.5mL)处理过夜。用IR120(H+)离子交换树脂中和后,蒸发溶剂,并将残余物通过快速色谱法(DCM/MeOH,1:0至4:1)纯化,得到为油状物的化合物12(2.86g,8.79mmol,95%)。

[α]D20-38.1(c 1.00,MeOH);1H NMR(500MHz,CD3OD):δ2.85(t,J=7.1Hz,2H,CH2CH2N3),3.49(t,J=7.1Hz,2H,CH2CH2N3),3.60(dd,J=3.4,9.7Hz,1H,H-3),3.70(m,1H,H-5),3.75-3.85(m,3H,H-2,H-6),3.93(d,J=3.2Hz,1H,H-4),4.86(d,J=7.8Hz,1H,H-1),7.09,7.20(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.6Hz,4H,C6H4);13C NMR(126MHz,CD3OD):δ35.49(CH2CH2N3),53.75(CH2CH2N3),62.44(C-6),70.25(C-4),72.34(C-2),74.89(C-3),76.96(C-5),103.11(C-1),118.00,130.82,133.65,158.08(6C,C6H4);ESI-MS:m/z:计算值C14H19N3NaO6[M+Na]+:348.13,实测值:348.04;IR(膜):2112cm-1(N3).

4-(2-叠氮基乙基)苯基3,4-异亚丙基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(13)

在氩气下向化合物12(2.86g,8.79mmol)在DMF(30mL)的溶液中加入2,2-二甲氧基丙烷(2.50mL,19.3mmol)和p-TsOH(37mg)。在80℃下搅拌过夜后,用TEA(0.5mL)中和反应混合物并蒸发溶剂。将残余物通过快速色谱法(石油醚+0.5%TEA/EtOAc,1:2至0:1)纯化,得到为油状物的13(2.39g,6.55mmol,75%)。

[α]D20-22.4(c 1.10,CHCl3);1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.34,1.53(2s,6H,Me2C),2.42(s,2H,2OH),2.81(t,J=7.1Hz,2H,CH2CH2N3),3.44(t,J=7.2Hz,2H,CH2CH2N3),3.78-3.85(m,2H,H-2,H-6a),3.93-4.00(m,2H,H-6b,H-5),4.14-4.21(m,2H,H-3,H-4),4.78(d,J=8.2Hz,1H,H-1),6.95,7.12(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.5Hz,4H,C6H4);13C NMR(126MHz,CDCl3):δ26.33,28.10(C(CH3)2),34.54(CH2CH2N3),52.53(CH2CH2N3),62.29(C-6),73.31(C-2),73.69(C-5),73.87(C-4),78.89(C-3),100.33(C-1),110.69(C(CH3)2),116.89,129.95,132.63,155.78(6C,C6H4);ESI-MS:m/z:计算值C17H23N3NaO6[M+Na]+:388.16,实测值:388.06;IR(膜):2099cm-1(N3).

4-(2-叠氮基乙基)苯基2,6-二-O-苄基-3,4-异亚丙基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(14)

将化合物13(1.02g,2.78mmol)溶解在DCM(15mL)中。加入15-冠-5(55μL,0.28mmol)、50%NaOH水溶液(37.5mL)和苄基溴(3.30mL,27.8mmol),并将双相混合物在60℃下回流下搅拌过夜。用4M的HCl水溶液中和反应混合物。将有机层分离并用DCM(2×50mL)萃取水相。将合并的有机层浓缩,并且将残余物通过快速色谱法(石油醚+0.5%TEA/EtOAc,1:0至3:1)纯化,得到为白色固体的化合物14(1.26g,2.31mmol,83%)。

[α]D20+8.4(c 1.00,CHCl3);1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.28,1.34(2s,6H,Me2C),2.76(t,J=7.3Hz,2H,CH2CH2N3),3.37(t,J=7.3Hz,2H,CH2CH2N3),3.60(dd,J=6.8,7.9Hz,1H,H-2),3.69-3.80(m,2H,H-6),3.97(ddd,J=1.8,4.7,6.8Hz,1H,H-5),4.13(dd,J=2.0,5.7Hz,1H,H-4),4.18(m,1H,H-3),4.46,4.54(AB的A,B,J=11.8Hz,2H,CH2Ph),4.78-4.85(m,3H,CH2Ph,H-1),6.69,7.03(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.6Hz,4H,C6H4),7.15-7.28(m,8H,2C6H5),7.34(d,J=7.4Hz,2H,2C6H5);13C NMR(126MHz,CDCl3):δ26.41,27.81(C(CH3)2),34.62(CH2CH2N3),52.62(CH2CH2N3),69.60(C-6),72.72(C-5),73.67(C-4),73.69(2C,2CH2Ph),79.08(C-3),79.26(C-2),101.09(C-1),110.27(C(CH3)2),117.23(2C,C6H4),127.63,127.69,127.72,128.26,128.32,128.40(8C,2C6H5),129.80(2C,C6H4),132.19,138.14(2C6H5),138.29,156.26(C6H4);ESI-MS:m/z:计算值C31H35N3NaO6[M+Na]+:568.25,实测值:568.21;IR(KBr):2096cm-1(N3).δ

4-(2-叠氮基乙基)苯基2,6-二-O-苄基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(15)

在60℃下将化合物14(1.26g,2.31mmol)在90%含水乙酸(50mL)中的溶液搅拌过夜。蒸发溶剂,并将残余物通过快速色谱法(DCM/MeOH,1:0至9:1)纯化,得到为油状物的15(1.17g,2.31mmol,定量)。

[α]D20-9.9(c 1.10,CHCl3);1H NMR(500MHz,CDCl3):δ2.76(t,J=7.3Hz,2H,CH2CH2N3),3.38(t,J=7.3Hz,2H,CH2CH2N3),3.59(dd,J=3.3,9.5Hz,1H,H-3),3.62-3.76(m,4H,H-2,H-5,H6),3.92(d,J=3.2Hz,1H,H-4),4.48(s,2H,CH2Ph),4.69(AB的A,J=11.5Hz,1H,CH2Ph),4.87(d,J=7.7Hz,1H,H-1),4.96(AB的B,J=11.5Hz,1H,CH2Ph),6.97,7.05(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.5Hz,4H,C6H4),7.15-7.31(m,10H,2C6H5);13C NMR(126MHz,CDCl3):δ34.58(CH2CH2N3),52.59(CH2CH2N3),68.92(C-4),69.41(C-6),73.20(C-3),73.74(C-5),73.81,74.91(2CH2Ph),78.87(C-2),101.86(C-1),117.19(2C,C6H4),127.75,127.83,128.03,128.27,128.47,128.60(8C,2C6H5),129.83(2C,C6H4),132.33,137.87(2C6H5),138.14,156.13(C6H4);ESI-MS:m/z:计算值C28H31N3NaO6[M+Na]+:528.22,实测值:528.22;IR(膜):2098cm-1(N3).

4-(2-叠氮基乙基)苯基4-O-苯甲酰基-2,6-二-O-苄基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(16)

向15(1.17g,2.31mmol)在甲苯(15mL)中的溶液中加入三原苯甲酸三甲酯(0.64mL,3.72mmol)和p-TsOH(118mg,0.62mmol)。将混合物在45℃搅拌过夜,然后浓缩并将残余物溶解在90%含水乙酸(15mL)中。将该溶液在60℃下搅拌2小时,浓缩,并将残余物通过快速色谱法(石油醚/EtOAc,9:1至7:3)纯化,得到为无色油状物的16(1.30g,2.14mmol,93%)。

[α]D20-8.4(c 1.00,CHCl3);1H NMR(500MHz,CDCl3):δ2.83(t,J=7.3Hz,2H,CH2CH2N3),3.44(t,J=7.3Hz,2H,CH2CH2N3)3.60-3.66(m,2H,H-6),3.87(dd,J=7.4,9.6Hz,1H,H-2),3.92(dd,J=3.5,9.6Hz,1H,H-3),3.96(t,J=6.2Hz,1H,H-5),4.41,4.48(AB的A,B,J=11.7Hz,2H,CH2Ph),4.78(AB的A,J=11.2Hz,1H,CH2Ph),4.99-5.07(m,2H,H-1,CH2Ph),5.63(d,J=2.8Hz,1H,H-4),7.06,7.12(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.5Hz,4H,C6H4),7.18-7.35(m,10H,2C6H5),7.43(t,J=7.8Hz,2H,C6H5),7.56(t,J=7.4Hz,1H,C6H5),8.04-8.09(m,2H,C6H5);13C NMR(126MHz,CDCl3):δ34.62(CH2CH2N3),52.63(CH2CH2N3),68.61(C-6),70.25(C-4),72.21(C-3),73.28(C-5),73.71,75.13(2CH2Ph),79.15(C-2),101.89(C-1),117.07(2C,C6H4),127.76,127.78,128.04,128.29,128.39,128.49,128.58,129.57(12C,3C6H5),129.93(2C,C6H4),130.10,132.46,133.38,137.79(6C,3C6H5),138.06,156.17(C6H4),166.38(CO);ESI-MS:m/z:计算值C35H35N3NaO7[M+Na]+:532.24,实测值:532.28;IR(膜):2102cm-1(N3).

4-(2-叠氮基乙基)苯基(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸甲酯)-(1→3)-4-O-苯甲酰基-2,6-二-O-苄基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(17)

在氩气下将三氯亚氨逐乙酸酯3(1.75g,2.63mmol)、16(1.30g,2.14mmol)和活化的分子筛(2g)悬浮在DCM(25mL)中。将混合物在室温下搅拌1小时,然后冷却至0℃。逐滴加入TMSOTf(58.4μL,0.32mmol)。将反应混合物温热至室温过夜,然后用TEA(150μL)中和并浓缩。将残余物通过色谱法(石油醚/EtOAc,9:1至7:3)纯化,得到为白色固体的17(2.04g,1.84mmol,86%)。

[α]D20+25.2(c 1.10,CHCl3);1H NMR(500MHz,CDCl3):δ2.84(t,J=7.3Hz,2H,CH2CH2N3),3.46(t,J=7.2Hz,2H,CH2CH2N3),3.61(dd,J=7.3,10.1Hz,1H,H-6a),3.67(s,3H,OMe),3.72(dd,J=4.7,10.2Hz,1H,H-6b),3.98(dd,J=7.9,9.5Hz,1H,H-2),4.02(dd,J=5.3,6.5Hz,1H,H-5),4.15(d,J=9.8Hz,1H,H-5’),4.24(dd,J=3.4,9.5Hz,1H,H-3),4.48(AB的A,B,J=11.5Hz,2H,CH2Ph),4.55,4.91(AB的A,B,J=10.7Hz,2H,CH2Ph),5.02(d,J=7.7Hz,1H,H-1),5.39(d,J=7.4Hz,1H,H-1’),5.47(dd,J=7.4,9.1Hz,1H,H-2’),5.69(t,J=9.5Hz,1H,H-4’),5.77(t,J=9.3Hz,1H,H-3’),5.81(d,J=3.3Hz,1H,H-4),7.02,7.10(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.7Hz,4H,C6H4),7.22-7.46,7.48-7.53,7.56-7.66,7.76-7.81,7.88-7.93,8.05-8.10(m,30H,6C6H5);13C NMR(126MHz,CDCl3):δ34.60(CH2CH2N3),52.59(CH2CH2N3),52.86(OMe),69.06(C-6),70.01(C-4),70.06(C-4’),71.83(C-2’),72.24(C-3’),72.94(C-5’),73.67(C-5),73.73,75.25(2CH2Ph),76.26(C-3),79.77(C-2),100.3(C-1’),101.81(C-1),117.02(2C,C6H4),127.69,127.76,127.98,128.10,128.30,128.37,128.43,128.56,128.75,128.94,129.09,129.60,129.77,129.82,129.87,129.94,130.10,132.39,132.92,133.08,133.26,133.38,137.85,137.92,156.09(40C,6C6H5,C6H4),164.47,165.00,165.51,165.64,167.16(5CO);ESI-MS:m/z:计算值C63H57N3NaO16[M+Na]+:1134.36,实测值:1134.47;IR(KBr):2099cm-1(N3).

4-(2-叠氮基乙基)苯基(β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸盐)-(1→3)-2,6-二-O-苄基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(18)

将化合物17(2.04g,1.84mmol)悬浮于THF(14mL)中并将该悬浮液冷却至-10℃。然后逐滴加入2M LiOH水溶液(10mL)。将反应混合物搅拌过夜并温热至室温。用IR-120(H+)离子交换树脂中和并过滤后,蒸发溶剂,将残余物溶解在THF/H2O(2:3,16mL)中,并用TFA(8mL)处理30分钟。将混合物蒸发至干燥,并将残余物通过反相色谱法(RP-18,MeOH/水,0:1至3:1)纯化,得到为固体的18(1.12g,1.64mmol,89%)。

[α]D20-48.1(c 1.00,MeOH);1H NMR(500MHz,CD3OD):δ2.79(t,J=7.0Hz,2H,CH2CH2N3),3.35-3.47(m,4H,H-2’,H-3’,CH2CH2N3),3.53(t,J=9.1Hz,1H,H-4’),3.73(m,2H,H-6),3.77(d,J=9.8Hz,1H,H-5’),3.81-3.89(m,2H,H-3,H-5),3.94(m,1H,H-2),4.06(d,J=2.5Hz,1H,H-4),4.53(s,2H,CH2Ph),4.74(d,J=7.3Hz,1H,H-1’),4.88-4.95(m,2H,CH2Ph),4.99(d,J=7.7Hz,1H,H-1),7.02,7.12(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.5Hz,4H,C6H4),7.20-7.34(m,8H,2C6H5),7.41(d,J=7.1Hz,2H,2C6H5);13C NMR(126MHz,CD3OD):δ33.97(CH2CH2N3),52.19(CH2CH2N3),68.85(C-4),69.18(C-6),71.78(C-4’),72.86(CH2Ph),73.32(C-2’),73.58(C-5),74.69(CH2Ph),74.93(C-5’),75.83(C-3’),78.50(C-2),80.64(C-3),101.39(C-1),104.07(C-1’),116.43(2C,C6H4),127.12,127.21,127.25,127.75,127.87,128.23(10C,2C6H5),129.44,132.31(3C,C6H4),138.22,138.38(2C6H5),156.25(C6H4),171.27(CO);ESI-MS:m/z:计算值C34H39N3NaO12[M+Na]+:704.24,实测值:704.30;IR(KBr):2099cm-1(N3).

4-(2-叠氮基乙基)苯基(2,4-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸甲酯)-(1→3)-4-O-乙酰基-2,6-二-O-苄基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(19)

将化合物18(900mg,1.32mmol)在Ac2O(15mL)中的溶液在80℃下搅拌1小时,然后冷却至室温。加入吡啶(9mL)和DMAP(25mg),并将反应混合物搅拌3天。将溶剂与甲苯(5×5mL)共蒸发。将残余物溶解在DCM(50mL)中,用盐水(50mL)和水(50mL)萃取。将有机相经硫酸钠干燥,并通过脱脂棉过滤。在溶剂蒸发后,将残余物溶于干燥MeOH(20mL)并加入无水醋酸钠(100mg)。将混合物搅拌过夜,用15(H+)离子交换树脂中和并过滤。浓缩滤液并通过快速色谱法(石油醚/EtOAc,2:1至2:3)纯化残余物,得到为浅黄色固体的19(794mg,0.97mmol,73%)。

[α]D20-32.6(c 1.00,CHCl3);1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.92,2.01,2.04(3s,9H,3OAc),2.77(t,J=7.2Hz,2H,CH2CH2N3),3.40(t,J=7.2Hz,2H,CH2CH2N3),3.48(dd,J=7.1,10.1Hz,1H,H-6a),3.55(dd,J=4.8,10.2Hz,1H,H-6b),3.61(m,1H,H-3’),3.67(s,3H,OMe),3.78-3.83(m,2H,H-5,H-5’),3.86(dd,J=7.6,9.7Hz,1H,H-2),3.91(dd,J=3.3,9.6Hz,1H,H-3),4.43(AB的A,B,J=11.7Hz,2H,CH2Ph),4.64(AB的A,J=11.6Hz,1H,CH2Ph),4.81-4.88(m,2H,H-1,H-2),4.91(d,J=7.6Hz,1H,H-1’),4.95(AB的B,J=10.6Hz,1H,CH2Ph),5.07(t,J=9.5Hz,1H,H-4’),5.38(d,J=3.0Hz,1H,H-4),6.96,7.04(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.5Hz,4H,C6H4),7.18-7.31(m,10H,2C6H5);13C NMR(126MHz,CDCl3):δ20.69,20.72,20.76(3COCH3),34.59(CH2CH2N3),52.58(CH2CH2N3),52.79(OCH3),68.93(C-6),69.30(C-4),71.91(C-4’),72.53(C-5),73.10(C-5’),73.38(C-3’),73.70(CH2Ph),73.87(C-2’),75.31(CH2Ph),77.24(C-3),79.19(C-2),100.10(C-1’),101.71(C-1),117.04(2C,C6H4),127.76,127.80,127.96,128.01,128.40,128.49(10C,2C6H5),129.85,132.41(3C,C6H4),137.87,137.96(2C6H5),156.08(C6H4),167.42,170.11,170.29,170.32(4CO);ESI-MS:m/z:计算值C41H47N3NaO15[M+Na]+:844.29,实测值:844.39;IR(KBr):2101cm-1(N3).

4-(2-叠氮基乙基)苯基(2,4-二-O-乙酰基-3-O-磺基-β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸甲酯)-(1→3)-4-O-乙酰基-2,6-二-O-苄基-β-D-半乳糖吡喃糖苷钠盐(20)

将化合物19(794mg,0.97mmol)溶解在干燥DMF(10mL)中并加入SO3·Py(846mg,5.31mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时,并用NaHCO3(719mg,8.56mmol)通过搅拌2小时淬灭反应。将固体滤出并用MeOH洗涤过滤器。使滤液通过Dowex50×8(Na+)离子交换柱。浓缩滤液,并将残余物通过快速色谱法(DCM/MeOH,1:0至9:1)纯化,得到为浅黄色固体的化合物20(808mg,0.88mmol,91%)。在快速色谱法后浓缩期间加入几滴0.1M的NaOH水溶液。

[α]D20-18.3(c 1.00,MeOH);1H NMR(500MHz,CD3OD):δ1.97,2.09,2.11(3s,9H,3OAc),2.86(t,J=7.0Hz,2H,CH2CH2N3),3.50(t,J=7.0Hz,2H,CH2CH2N3),3.54(dd,J=7.4,10.4Hz,1H,H-6a),3.65(dd,J=4.4,10.4Hz,1H,H-6b),3.75(s,3H,OMe),3.86(dd,J=7.9,9.5Hz,1H,H-2),4.07(dd,J=4.6,7.1Hz,1H,H-5),4.09-4.14(m,2H,H-3,H-5’),4.49-4.57(m,2H,CH2Ph),4.66(t,J=9.2Hz,1H,H-3’),4.80(AB的A,J=10.7Hz,1H,CH2Ph),4.96-5.03(m,2H,CH2Ph,H-2’),5.06(d,J=7.9Hz,1H,H-1’),5.11-5.17(m,2H,J=8.2Hz,H-1,H-4’)5.48(d,J=3.6Hz,1H,H-4),7.07,7.18(的AA’BB’AA’,BB’,J=8.5Hz,4H,C6H4),7.29-7.44(m,10H,2C6H5);13C NMR(126MHz,CD3OD):δ20.87,21.20(3C,3COCH3),35.50(CH2CH2N3),53.24(CH2CH2N3),53.71(OMe),70.27(C-6),71.08(C-4),71.37(C-4’),72.95(C-2’),73.50(C-5’),74.14(C-5),74.41,76.26(2CH2Ph),78.98(C-3’),80.02(C-3),80.11(C-2),101.62(C-1’),102.61(C-1),117.93(2C,C6H4),128.69,128.79,128.90,129.17,129.37,129.43(10C,2C6H5),131.02,134.06(3C,C6H4),139.56,139.72(2C6H5),157.58(C6H4),164.89,169.39,171.64,171.75(4CO);ESI-MS:m/z:计算值C41H46N3O18S[M-H]-:900.25,实测值:900.42;IR(KBr):2101cm-1(N3).

4-(2-氨基乙基)苯基(3-O-磺基-β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸二钠)-(1→3)-β-D-半乳糖吡喃糖苷(21)

在-10℃下向20(470mg,0.51mmol)在THF/H2O(10:1,10mL)的溶液中加入2M LiOH水溶液(2mL)。将反应混合物温热至室温并搅拌过夜。用Amberlyste 15(H+)离子交换树脂中和并过滤反应混合物。用MeOH使滤液通过50X8(Na+)离子交换柱,并浓缩。将残余物通过快速色谱法(DCM/MeOH/H2O,10:3:0.3)纯化。在浓缩产物期间,加入几滴0.1M的NaOH水溶液,之后将其溶解在MeOH(4.5mL)和H2O(3.75mL)中。在氩气下加入AcOH(0.2mL)和Pd(OH)2/C(94mg,20%),并将反应混合物在氢气(1个大气压)气氛下搅拌过夜。将催化剂通过硅藻土垫过滤并将该垫用MeOH和几滴H2O洗涤。将滤液浓缩并用P2尺寸排阻色谱法纯化残余物,冷冻干燥后得到为无色固体的21(238mg,0.40mmol,78%)。

[α]D20-25.6(c 1.00,H2O);1H NMR(500MHz,D2O):δ2.99(t,J=7.0Hz,2H,CH2CH2NH2),3.28(t,J=7.1Hz,2H,CH2CH2NH2),3.66(t,J=8.4Hz,1H,H-2’),3.71-3.88(m,5H,H5,H-6,H-4’,H-5’),3.92(dd,J=3.2,9.9Hz,1H,H-3),3.99(t,J=8.6Hz,1H,H-2),4.26(d,J=3.1Hz,1H,H-4),4.39(t,J=9.0Hz,1H,H-3’),4.82(d,J=7.9Hz,1H,H-1’),5.12(d,J=7.7Hz,1H,H-1),7.17,7.32(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.0Hz,4H,C6H4);13C NMR(126MHz,D2O):δ31.97(CH2CH2NH2),40.65(CH2CH2NH2),60.78(C-6),68.05(C-4),69.02(C-2),70.50(C-4’),72.03(C-2’),75.10(2C,C-5,C-5’),82.43(C-3),83.60(C-3’),100.46(C-1),103.24(C-1’),117.01,130.30,131.29,155.75(6C,C6H4),175.45(CO);ESI-MS:m/z:计算值C20H27NNa2O15S[M-2Na+H]-:554.12,实测值:554.07.

4-(2-(4-巯基丁酰胺基)乙基)苯基(-3-O-磺基-β-D-葡萄糖吡喃糖醛酸二钠)-(1→3)-β-D-半乳糖吡喃糖苷(22)

向21(238mg,0.40mmol)在DMF(8mL)中的悬浮液中加入二硫苏糖醇(112mg,0.72mmol)、硫代丁内酯(343μL,4mmol)和TEA(552μL,4mmol)。将混合物在85℃下搅拌18小时。将溶剂与甲苯(3×5mL)共蒸发,并将残余物通过快速色谱法(DCM/MeOH/H2O,10:5:1)纯化。浓缩产物的过程中,加入几滴0.1M的NaOH水溶液。冻干得到为无色固体的22(164mg,0.234mmol,59%)。

[α]D20-20.2(c 1.00,H2O);1H NMR(500MHz,D2O):δ1.72-1.85(m,2H,CH2CH2CH2SH),2.28(t,J=7.2Hz,2H,CH2CH2CH2SH),2.37(t,J=7.2Hz,2H,CH2CH2CH2SH),2.83(t,J=6.5Hz,2H,CH2CH2NH),3.49(t,J=6.5Hz,2H,CH2CH2NH),3.67(dd,J=8.1,9.1Hz,1H,H-2’),3.73-3.91(m,5H,H-5,H6,H-4’,H-5’),3.94-4.02(m,2H,H-2,H-3),4.29(d,J=2.7Hz,1H,H-4),4.39(t,J=9.1Hz,1H,H-3’),4.84(d,J=7.9Hz,1H,H-1’),5.13(d,J=7.4Hz,1H,H-1),7.14,7.27(AA’BB’的AA’,BB’,J=8.5Hz,4H,C6H4);13C NMR(126MHz,D2O):δ22.87(CH2CH2CH2SH),29.44(CH2CH2CH2SH),33.63(CH2CH2NH),34.34(CH2CH2CH2SH),40.25(CH2CH2NH),60.77(C-6),68.04(C-4),69.03(C-2),70.47(C-4’),72.02(C-2’),75.10(C-5),76.10(C-5’),82.48(C-3),83.62(C-3’),100.67(C-1),103.26(C-1’),116.72,130.19,133.93,155.24(6C,C6H4),175.43,175.79(2CO);HRMS:m/z:计算值C24H33NNa2O16S2[M+H]+:702.1109,实测值:702.1104.

氯乙酰化聚赖氨酸(24)

在氩气下将聚赖氨酸氢溴酸盐(23)(Sigma P2636,MW 30-70kD,0.50g,2.4mmol)悬浮于DMF(5mL)和2,6-二甲基吡啶(1.25mL)的混合物中。将该悬浮液冷却至0℃,并缓慢加入氯乙酸酐(513mg,3.00mmol)在DMF(1mL)中的溶液。在0℃下将所得透明溶液搅拌16小时。将产物通过滴加反应混合物至乙醇/乙醚(1:1,40mL1)的搅拌溶液而沉淀。将沉淀物滤出,用乙醇/乙醚(1:1,20mL)洗涤并浓缩,得到24(449mg,96%)。1H NMR数据与文献值(G.Thoma et al.,J Am Chem Soc 1999,121:5919-5929)一致。

最小HNK-1聚合物(25)

随后向24(80.2mg,0.39mmol)在DMF(4mL)的溶液中加入化合物22(110mg,0.16mmol)、水(200μL)和DMF(0.8mL)中的DBU(88μL,0.59mmol)。搅拌1小时后,加入硫代甘油(102μL,1.18mmol)和TEA(164μL,1.18mmol),并将反应混合物搅拌18小时。将产物通过滴加反应混合物至乙醇/乙醚(1:1,30mL)的搅拌溶液而沉淀。将沉淀滤出,用乙醇/乙醚(1:1,15mL)洗涤并干燥。通过超滤来实现进一步纯化。将干燥的产物溶解在水(10mL)中,并使用两个Sartorius Stedim Vivaspin 6管(体积,6mL,直径,17毫米,截留分子量5000)进行超速离心。超滤重复进行四次,从10mL降低到3mL,每次都将其体积用水填满。冻干得到HNK-1聚合物25(139mg,70%)。根据1H NMR,产物含有约44%的单体碳水化合物单元连接至聚合物。

方案3:最小HNK-1聚合物30的合成

试剂和条件:a)TEA,CHCl3,46%;b)AIBN,苯,84%;c)i.DMF,DMSO,DBU,TEA;ii.MeNH2/MeOH,39%。

2,5-二氧代吡咯烷-1-基丙烯酸酯(28)

在氩气下向N-羟基琥珀酰亚胺(27)(6.41g,55.8mmol)和NEt3(8.5mL,61.0mmol)在CHCl3(100mL)中的冷却(冰浴)溶液逐滴加入丙烯酰氯(26)。加入过程中混合物的温度保持低于12℃。搅拌2.5小时后,接着用冰水(100mL)、水(100mL)和盐水(100mL)洗涤反应混合物。将有机相经硫酸钠干燥,过滤,在真空中浓缩至15mL,并通过硅藻土垫过滤。用CHCl3(15mL)洗涤硅藻土,用EtOAc(2mL)和石油醚(11mL)稀释滤液,并储存于-20℃过夜。将形成的沉淀滤出并真空干燥,得到为白色针状物的28(4.30g,25.4mmol,46%)。

活化的聚丙烯酸酯(29)

在60℃下将28(2.10g,12.4mmol)和AIBN(133mg,0.81mmol)在干燥苯(100mL)中的溶液加热1天。将形成的沉淀滤出,用干燥THF洗涤并在真空中干燥,得到为白色固体的29(1.70g,81%)。通过凝胶渗透色谱法(GPC)用瓦里安聚苯乙烯校准试剂盒S-M2-10作为标准来测定29的分子量。Mn=13.9kD,Mw=55.3kD,Mz=127.4kD,MP=39.0kD,Mw/Mn=3.99。

最小HNK-1聚合物(30)

将化合物22(51mg,0.085mmol)、DBU(10.5mg,0.183mmol)和聚合物29(29mg)溶解在DMF(0.5mL)和DMSO(1mL)中。将反应混合物搅拌18小时。然后,加入MeNH2(0.5mL,在MeOH中的33%溶液),并继续搅拌19小时。随后将混合物用10kD截留膜在水(1L)、甲酸铵水溶液(40mM,1升)、甲酸铵水溶液(60mM,2×1L)和水(2×1L)中进行透析。最后冻干得到为铵盐的最小HNK-1聚合物30(27mg,39%)。根据1H NMR,产物含有约50%的单体碳水化合物单元连接至聚合物。

患者血清

对四例患者(三男一女)的血清进行了研究。他们都被测试为单克隆IgM丙种球蛋白病阳性并被巴塞尔大学医院(巴塞尔,瑞士)诊断为抗-MAG神经病变。通过ELISA测定法(Bühlmann Laboratories,瑞士)测定血清抗-MAG抗体效价。来自有单克隆IgM丙种球蛋白病和阴性抗-MAG活性的两个患者的血清作为对照。巴塞尔大学医院的伦理委员会批准使用血清。

竞争性结合测定

抗-MAG ELISA试剂盒(Bühlmann Laboratories,瑞士)用于化合物1、2和25的生物学评价。涂覆有来自人脑的纯MAG的96孔板用洗涤缓冲液(300μL/孔)洗涤四次,之后加入七种不同浓度的碳水化合物配体(单体1和2为0.05-50mM,聚合物25为0.05-5'000nM),25μL/孔。以适当的稀释液加入含有抗-MAG IgM抗体的患者血清,25μL/孔。一式两份进行测量。该孔板用板密封加盖并在5℃下培养2小时。用洗涤缓冲液(300μL/孔)洗涤孔板四次,之后加入酶标记的IgM(在具有防腐剂的基于蛋白质的缓冲液中的缀合到辣根过氧化物酶的抗人IgM抗体)(100μL/孔)。将该孔板在5℃下培养2小时。洗涤各孔(4×300μL/孔)后,加入四甲基联苯胺的底物溶液(TMB在有过氧化氢的柠檬酸缓冲液中)(100μL/孔),并将该孔板在800rpm和室温下避光培养另外30分钟。最后,加入终止溶液(0.25M的硫酸)(100μL/孔),并用酶标仪(Spectramax 190,Molecular Devices,加利福尼亚州,美国)通过450nm处的吸收测量测定比色反应的程度。

再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1