宫颈病变疾病的生物诊治标志物的制作方法

文档序号:18145657发布日期:2019-07-10 11:47
宫颈病变疾病的生物诊治标志物的制作方法

本发明属于生物医药领域,涉及宫颈病变疾病的生物诊治标志物,具体的涉及标志物为BDKRB2。



背景技术:

宫颈癌是女性较常见的恶性肿瘤,发病率位于女性肿瘤的第二位,占女性生殖系统恶性肿瘤发病率的73%~93%。我国每年新增发病数超过13万,特别值得注意的是,由于环境污染加上生活中的不良卫生习惯,使原本多发于50岁左右女性的宫颈癌,如今也越来越年轻化。流行病学研究发现宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(HPV)感染关系密切,尤其是高危型HPV感染。但HPV感染并不是独立致病因素。从HPV感染、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)到宫颈癌这种金字塔式的分布表明宫颈癌形成过程除了HPV感染以外还存在其他的必要因素,宫颈癌的发生发展应是宿主遗传因素和HPV共同作用的结果。

近年来随着肿瘤分子生物学研究的深入,发现基因在癌症的引发、癌前细胞和癌细胞的生存生长中起着重要的作用。探讨基因在宫颈病变疾病发生发展中的意义,明确其在宫颈癌变过程各阶段中的作用,可为临床判定分期、判断预后提供参考,为治疗、预防肿瘤开辟新途径。



技术实现要素:

为了弥补现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种与宫颈疾病:宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌发生发展相关的基因标志物,研究该标志物在宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌中的作用,为疾病提供精准化诊断和治疗。

为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:

本发明的第一方面提供了一种试剂,所述试剂能够检测BDKRB2基因或其表达产物的水平。

进一步,所述试剂包括针对BDKRB2的探针、引物或抗体。

进一步,针对BDKRB2的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。

本发明的第二方面提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第三方面提供了一种芯片,所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第四方面提供了一种核酸膜条,所述核酸膜条包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第五方面提供了一种组合物,所述组合物包括BDKRB2的促进剂,和/或药学上可接受的载体。所述促进剂包括提高BDKRB2基因或其表达产物稳定性、上调BDKRB2基因或其表达产物的表达水平、增加BDKRB2基因或其表达产物有效作用时间的物质。

进一步,所述促进剂为过表达BDKRB2的载体。

本发明的第六方面提供了一种筛选治疗宫颈鳞癌的候选药物的方法,所述方法包括:

用待筛选物质处理表达或含有BDKRB2基因或其编码的蛋白的培养体系;和检测所述体系中BDKRB2基因或其编码的蛋白的表达或活性;

其中,若所述待筛选物质可以促进BDKRB2基因的水平或表达活性,则表明该待筛选物质是治疗宫颈鳞癌的候选药物。

在本发明中,所述体系包括(但不限于):细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在本发明中,所述的步骤还包括:对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验,以从候选药物中进一步选择可以治疗宫颈鳞癌的药物。

本发明的第七方面提供了如下任一项所述的应用:

a.本发明第一方面所述的试剂、本发明第二方面所述的试剂盒、本发明第三方面所述的芯片、本发明第四方面所述的核酸膜条在制备早期诊断宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的产品中的应用;

b.本发明第五方面所述的组合物在制备治疗宫颈鳞癌及其转移、侵袭的药物中的应用;

c.BDKRB2在制备治疗宫颈鳞癌及其转移、侵袭的的药物中的应用。

附图说明

图1是利用QPCR检测BDKRB2基因在宫颈鳞癌患者中的表达情况;

图2是BDKRB2基因表达水平图;

图3是CCK-8法检测BDKRB2对细胞增殖活性的影响图;

图4是利用transwell小室检测BDKRB2基因对细胞迁移侵袭的影响图,其中图A是对细胞迁移的影响图;图B是对细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明通过高通量测序技术以及进行高通量测序分析,检测宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌患者组织中的基因表达水平,发现其中表达具有明显差异的基因,探讨其与宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的发生之间的关系,从而为宫颈鳞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。经过筛选本发明首次发现了BDKRB2在宫颈鳞癌患者中表达下调,并通过基因过表达技术进一步验证了BDKRB2参与宫颈癌细胞的增殖、侵袭过程,提示BDKRB2可作为宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的分子靶标应用于疾病的诊断和治疗。

BDKRB2基因

本发明中的BDKRB2的基因ID为624,在本发明中,BDKRB2包括野生型、突变型或其片段。本领域技术人员知道,在进行测序分析时,会将原始测序结果比对到人的参考基因组上,因此筛选结果中的BDKRB2可能会包含不同的转录本,只要可以比对到参考基因组上的BDKRB2(基因ID:624)即可。一种代表性的BDKRB2的序列如NM_000623.3所示。

本发明的BDKRB2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解,测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平或翻译水平上检测生物标志物的表达水平。

本文所用术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较,经测定mRNA的量或水平,在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物mRNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。“差异表达的”还可以包括与第二种样品或样品群中蛋白质表达量或水平比较,对样品或样品群中本发明生物标志物编码的蛋白质的测定。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较,经测定RNA的量和/或蛋白质的量,样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较,样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。本文所用“差异表达”可以用给定生物标志物的表达水平相对于对照中给定生物标志物的平均表达水平的比率进行测定,其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异表达。当使用p值时,当p值小于0.1时生物标志物被鉴定为在第一和第二群体之间差异表达。更优选p值小于0.05。甚至更优选p值小于0.01。还更优选p值小于0.005。最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异表达时,如果第一种和第二种样品中表达水平的比率大于或小于1.0,则RNA或蛋白质是差异表达的。举例来说,大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率,或小于1的比率,例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中,如果第一群体的平均表达水平与第二群体的平均表达水平的比率大于或小于1.0,则核酸转录本是差异表达的。举例来说,大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率,或小于1的比率,例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中,如果第一个样品中表达水平与第二个群体中平均表达水平的比率大于或小于1.0,例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20,或比率小于1,例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05,则核酸转录本是差异表达的。

“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言,基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示增加至少10%或更多,例如20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言,基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示降低至少10%或更多,例如20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如,上调基因包括与从正常个体分离的mRNA或蛋白质的表达相比,从以患有宫颈病变疾病为特征的个体分离的组织中mRNA或蛋白质表达水平增加的基因。例如,下调基因包括与从正常个体分离的组织相比,从以患有宫颈病变疾病为特征的个体分离的组织中mRNA或蛋白质表达水平降低的基因。

本发明的基因和蛋白使用本领域普通技术人员已知的多种技术进行检测,这些技术包括但不限于:核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中,PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR),TMA和NASBA直接扩增RNA。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。

本发明的蛋白免疫技术包括夹心免疫测定,例如夹心ELISA,其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测;放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

检测BDKRB2蛋白的试剂为BDKRB2蛋白的特异性结合剂。特异性结合剂是例如蛋白质BDKRB2的受体、结合蛋白质BDKRB2的凝集素、针对蛋白质BDKRB2的抗体、针对蛋白质BDKRB2的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。

特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。在本发明的具体实施例中,所述特异性结合剂为BDKRB2特异性抗体。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位,除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外,此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体,其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如,选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解,选定的靶物结合序列可进一步改变,例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等,而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外,单克隆抗体制备物的优势在于它们一般未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征,不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分,一般是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;及由抗体片段形成的多特异性抗体。

本发明的抗体的“功能性片段”指那些保留与衍生它们的完整全链分子以基本上相同的亲和力结合多肽且在至少一种测定法中有活性(诸如在小鼠模型中,或在体外抑制抗体片段结合的抗原的生物学活性)的片段。

本发明提供了检测BDKRB2的表达水平的产品,所述产品包括(但不限于)芯片、试剂盒、核酸膜条。其中芯片包括:固相载体;以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针或抗体,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于BDKRB2所示的部分或全部序列,所述抗体特异性的结合BDKRB2蛋白。

所述固相载体包括无机载体和有机载体,所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等;所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

本发明提供了一种试剂盒,所述试剂盒可用于检测BDKRB2基因或蛋白的试剂。选自下组的一种或多种物质:容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书,其中记载了如何采用试剂盒进行检测。

在某些实施方案中,本文提供的是用于检测一种或多种生物标志物的蛋白质水平的试剂盒。在某些实施方案中,所述试剂盒包含用识别蛋白质生物标志物的抗体包被的试纸条、洗涤溶液、进行该试验的试剂、蛋白质分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中,所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。

本发明提供了一种核酸膜条,核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针;所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底,例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

促进剂和药物组合物

本发明提供了一种药物(组合物),它含有有效量的所述的BDKRB2的促进剂,以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于治疗宫颈鳞癌。

作为本发明的一种优选方式,所述的BDKRB2的促进剂是一种BDKRB2的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

药学可接受的载体或稀释剂的实例是软化水或蒸馏水;盐水溶液;植物油类,如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油,麻油类,如花生油(peanutoil)、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、麻油、花生油(arachisoil)或椰子油;硅油类,包括聚硅氧烷类,如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷;挥发性硅酮类;矿物油类,如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷;纤维素衍生物,如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素;低级烷醇类,例如乙醇或异丙醇;低级芳烷醇类(aralkanols);低级聚烷撑二醇类或低级烷撑二醇类,例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油;脂肪酸酯类,如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯;聚乙烯吡咯烷酮;琼脂;黄耆树胶或阿拉伯胶和凡士林。一般载体或多种载体形成组合物的10wt%至99.9wt%。

组合物可以是适合注射给药的剂型、适合口服摄取的剂型(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的油膏、乳膏或洗剂形式、适合用作滴眼剂的递送剂型、适合通过吸入给药的气雾剂形式(如通过鼻内吸入或口吸入)、适合胃肠外给药的剂型,即皮下、肌肉内或静脉内注射。

对于可注射溶液或悬液的给药,无毒的胃肠外可接受的稀释剂或载体可包括林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1,2丙二醇。

用于口服的合适载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯胶、黄耆树胶、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外,这些口服剂型可含有合适的调味剂和着色剂。当以胶囊剂型使用时,胶囊可用能延缓崩解的化合物包被,如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

佐剂典型地包括润滑剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。

口服给药的固体剂型可包含在人和兽医药学实践中可接受的粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂(timedelayagent)。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄耆树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、柑橘或树莓调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

用于口服给药的液体剂型除了上述药物以外,还可包含液体载体。合适的液体载体包括水、油类如橄榄油、花生油(peanutoil)、麻油、向日葵油、红花油、花生油(arachisoil)、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。

用于口服给药的悬液可进一步包括分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙稀吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰乙醇。合适的分散剂包括卵磷脂、如硬脂酸之类的脂肪酸的聚氧乙烯酯类、聚氧乙烯山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯和类似物。

用于口服给药的乳剂可进一步包括一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括上面所例举的分散剂或天然树胶,如瓜尔胶、阿拉伯胶或黄耆树胶。

本发明的药物组合物还可以与其他治疗宫颈鳞癌的药物联用,其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药,甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。

优选的,可采用基因治疗的手段进行。比如,可直接将BDKRB2的促进剂通过诸如注射等方法给药于受试者;或者,可通过一定的途径将携带BDKRB2的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上,具体情况需视所述的促进剂的类型而定,这些均是本领域技术人员所熟知的。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明,本发明的实施例仅用于解释本发明,并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

下述实施例中所用的澳门彩票、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

实施例1筛选与宫颈鳞癌相关的基因标志物

1、样本收集

收集32例宫颈鳞癌(CESC)组织和18正常组织(N),24例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)组织,所有病例术前未做任何免疫抑制剂治疗、放疗以及化疗,所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取4例标本进行基因表达谱的检测分析,进行差异表达基因的筛选,并在各组全部病例标本中进行验证实验。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取各组组织中的总RNA,具体步骤参考说明书。

3、RNA样品的质量分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳,利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg,浓度≥200ng/μL,OD260/280介于1.8~2.2之间。

4、cDNA文库的构建

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建,具体操作按说明书进行。

5、测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序,具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析,采用metaMA包分析,meta分析中p值合并所用方法为inverse normal method,差异表达基因的筛选标准是FDR<0.05。

7、结果

RNA-seq结果显示,与正常对照相比,BDKRB2基因在宫颈鳞癌组织、以及在宫颈上皮内瘤样病变组织中的表达量显著下调,其中宫颈鳞癌组织中的表达量与宫颈上皮内瘤样病变组织相比,表达量也显著下调,差异具有统计学意义,因此对BDKRB2进行进一步的大样本验证。

实施例2QPCR测序验证BDKRB2基因的差异表达

1、对BDKRB2基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取各组组织中的总RNA,具体步骤参考说明书。

3、QPCR

1)逆转录反应

采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号:KR106)进行lncRNA反转录,首先去除基因组DNA反应,在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl,总RNA 1μg,加RNase Free ddH2O使总体积至10μl,水浴锅中42℃加热3min.

将10×Fast RT Bμffer 2.0μl,RT Enzyme Mix 1.0μl,FQ-RT Primer Mix 2.0μl,RNase Free ddH2O 5.0μl,混合后加入上述试管中一起混合共20μl,水浴锅中42℃加热15min,95℃加热3min。

2)引物设计

根据Genebank中BDKRB2基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物,由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下:

BDKRB2基因:

正向引物为5’-GAGTGTCATCACCTTCTG-3’(SEQ ID NO.1);

反向引物为5’-TCTGGATCTCCTTGAACT-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因:

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3);

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

3)QPCR扩增检验

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号:FP205),进行扩增,实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系:2×SuperReal PreMix Plus 10μl,正反向引物(10μM)各0.6μl,5×ROX Reference Dye△2μl,DNA模板2μl,灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管,所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为:95°15min,(95℃10s,55℃30s,72℃32s)×40个循环,95℃15s,60℃60s,95℃15s)。

4)cDNA模板浓度的筛选

将各样本cDNA混合后,以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释,稀释后样品各取2μl作模板,分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增,同时在60-95℃进行融解曲线分析,根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线,可以看出,当cDNA的进行10倍稀释时,PCR的扩增效率较高,溶解曲线单峰比较好。

5)样品RealTime PCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板,分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,2-ΔΔCT法进行相对定量。

4、结果

结果如图1所示,与正常组织相比,宫颈鳞癌组织和宫颈上皮内瘤样病变组织中的BDKRB2表达量显著下调,其中宫颈上皮内瘤样病变组织与正常组织相比,呈现显著性下调,宫颈鳞癌组织与宫颈上皮内瘤样病变组织相比,呈现显著性下调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

实施例3 BDKRB2基因的过表达

根据NCBI中BDKRB2基因序列信息设计特异性引物,进行扩增获得相应基因,将基因片段胶回收后分别与表达载体pEGFP-C1进行连接后转化入DH5α感受态细胞中,挑取阳性克隆经PCR和测序鉴定后获得pEGFP-C1-BDKRB2重组质粒。

1、细胞培养

宫颈鳞癌细胞(Hela)用含10%胎牛血清和1%P/S的RPIM-1640培养基在37℃、5%CO2的培养箱中培养,当细胞长至80%~90%时,使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、转染

将实验分为3组,分别为对照组(Hela)、空白对照组(转染pEGFP-C1)、实验组(转染pEGFP-C1-BDKRB2),按照invitrogen公司的lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。步骤如下:

1)对数生长期的细胞消化轻轻吹打成单细胞悬液,用不含抗生素的培养基接种于6孔板,6孔板的细胞密度达2×105个/孔,当细胞融合率达40%-60%进行转染试验;

2)次日转染,取10μl Lipofectamine 2000稀释于200μl不含血清的Opti-MEMI培养基,室温静置5min;

3)取4μg质粒溶于200μl无血清的Opti-MEM I培养基;

4)将上述两种稀释液混合均匀,室温孵育20分钟;质粒和转染试剂的比例为每孔4μg:10μl;

5)将6孔板中细胞更换1.6ml新鲜RPIM-1640培养基。将上述混悬液分别加入到6孔板中,每孔培养液终体积为2ml;

6)转染6小时后更换2ml新鲜完全培养液继续培养;

7)72h收集细胞,提取RNA,进行QPCR检测。

3、QPCR检测BDKRB2基因的转录水平

1)细胞总RNA的提取

采用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取,具体步骤详见试剂盒说明书

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,过表达BDKRB2基因表达组与对照组之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2显示,相比对照组Hela和转染空载pEGFP-C1,实验组pEGFP-C1-BDKRB2能够显著增加BDKRB2基因的表达水平,差异具有统计学意义。

实施例4 CCK-8法检测宫颈鳞癌细胞增殖活性

1、转染6小时后用0.25%胰蛋白酶消化细胞,用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液(1×104/孔),接种于96孔培养板中(100μl/孔),每组各设6个复孔,同时设立无细胞的培养液空白对照。

2、于检测时间点(0h,24h,48h,72h,96h,120h)分别加入细胞增殖检测试剂CCK-8,工作浓度为1:10,即100μl培养液加入10μl CCK-8;

3、在37℃,5%CO2孵育箱中孵育1h后,进行检测,酶标仪读数OD 450nm。

4、结果判断:转染后0h,24h,48h,72h,96h,120h使用酶标仪观察Hela细胞的增殖活性,细胞在波长450nm处的吸光光度值(OD值)表示处于增殖状态的细胞数量,以无细胞的培养液组OD值为对照。

5、结果

结果如图3所示,转染pEGFP-C1-BDKRB2的实验组的细胞增殖显著减少,提示改变BDKRB2的表达水平可以改变宫颈鳞癌细胞的增殖能力,说明BDKRB2与宫颈鳞癌细胞的增殖相关,提示BDKRB2可作为靶标应用于宫颈鳞癌的治疗。

实施例5 Transwell方法检测宫颈鳞癌细胞迁移和侵袭

1、细胞迁移能力检测

1)迁移前一天将完全培养基加入孔板中,放入小室置于培养箱中过夜;

2)将转染48h后的细胞进行饥饿处理,收集细胞计数,用0.2%BSA的无血清培养基制成1×105的悬液。

3)取200μl细胞悬液接种于Transwell小室内培养。

4)取出小室,吸干剩余液体后置于70%甲醇固定30min,用棉签擦去上室面的细胞。

5)小室浸入0.4%结晶紫染色10min,PBS清洗两遍,显微镜下随机选取视野计数膜底面的细胞数。

2、细胞侵袭能力检测

1)侵袭实验前一天在冰上用RPIM 1640 1:8稀释基质胶,每个24孔悬挂式小室底部膜上室面加稀释后的基质胶60μl干燥待用。

2)水化基底膜:每孔加入50μl含10g/LBSA的无血清培养液,37℃,30min,吸出培养板中残余液体。

3)将转染48h后的细胞进行饥饿处理,收集细胞计数,用0.2%BSA的无血清培养基制成1×105的悬液。

4)取出小室,吸干剩余液体后置于70%甲醇固定30min,用棉签擦去上室面的细胞。

5)小室浸入0.4%结晶紫染色10min,PBS清洗两遍,显微镜下随机选取视野计数膜底面的细胞数。

3、数据处理

用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

4、结果

结果如图4所示,实验组的细胞迁移和侵袭数分别较转染空白质粒的少,说明过表达BDKRB2基因降低宫颈鳞癌细胞的迁移和侵袭能力,提示BDKRB2可作为分子靶标应用于宫颈鳞癌转移和侵袭的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 宫颈病变疾病的生物诊治标志物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagtgtcatc accttctg 18

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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