用于检测六种曲霉的LAMP引物组合及其应用的制作方法

文档序号:18145672发布日期:2019-07-10 11:47
用于检测六种曲霉的LAMP引物组合及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种用于检测六种曲霉的LAMP引物组合及其应用。



背景技术:

侵袭性真菌病(invasive fungal disease,IFD)又称侵袭性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)、深部真菌感染(deep fungal infection,DFI),是指真菌侵入人体组织、血液,在其中生长和繁殖,引起炎症反应,并导致组织损害、器官功能障碍的病理生理过程。近二三十年来,随着实体器官和造血干细胞移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂等新技术在临床中的广泛应用,使侵袭性真菌病的发病率和病死率逐年升高,已日益成为导致住院患者死亡的主要原因之一。由于感染侵袭性真菌病多发于入住ICU,高龄,糖尿病,恶性血液系统疾病,念珠菌定植,侵袭性操作,应用抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂等人群中,其机体免疫力低下,重症死亡率高,因此对侵袭性真菌感染的早期检测及确定感染菌种有极为重要的意义。

曲霉菌病通常由曲霉(Aspergillus)导致,经常导致人肺部疾病或损害免疫系统。曲霉菌的孢子约2-5μM大小,易悬浮在空气中。多数人吸入孢子并不会感染疾病,但免疫能力低下或有肺部疾病的患者具有更高的感染率,引起感染或继发感染,如过敏性支气管曲霉菌病、过敏性曲霉鼻窦炎、曲霉瘤、慢性肺曲霉病、侵入性曲霉病、皮肤曲霉病等。2011年刘又宁等对中国1998年至2007年临床确诊的肺真菌病患者的多中心回顾性调查显示肺曲霉病为37.9%,排第一位。

现有的侵袭性真菌感染检测方法主要包括常规检查法和特殊检查法两种。其中常规检查法主要包括:1)真菌显微镜检,即直接涂片染色镜检;2)真菌培养鉴定;3)组织病理学检查。特殊检查法主要包括:1)血清学检查;2)分子生物学检查。其中常规检查法仍被视为确诊侵袭性真菌感染的基石,但其存在敏感度较低,操作繁复,阴性结果不能排除诊断,检测周期较长(通常需要几天到几周的时间)等问题,而导致延误病情及用药,增加死亡率等;血清学检测难以排除真菌某些属的种间抗原抗体交叉反应从而导致误判。相较前两种方法,分子生物学技术具有高特异性和高准确性的优点,并可从基因水平阐明真菌种群之间和中内的分类学关系,因而在近年来越来越得到广泛认可和应用。目前建立的相关分子学诊断方法有普通PCR方法、脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、实时荧光定量PCR技术(RTFQ-PCR)等,其共有的问题是对实验操作要求较高,检测时间较长(2.5h-3h)左右。因此,建立快速准确的分子诊断方法,为临床提供早期诊疗依据是解决现状的关键。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一种用于检测六种曲霉的LAMP引物组合及其应用。

本发明首先提供了引物组合,由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ和引物组Ⅵ组成;

所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成;

所述引物Ⅰ-F3为如下(a1)或(a2):

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子;

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-B3为如下(a3)或(a4):

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子;

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-FIP为如下(a5)或(a6):

(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子;

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-BIP为如下(a7)或(a8):

(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子;

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-LF为如下(a9)或(a10):

(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子;

(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-LB为如下(a11)或(a12):

(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子;

(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子;

所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成;

所述引物Ⅱ-F3为如下(b1)或(b2):

(b1)序列表的序列7所示的单链DNA分子;

(b2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-B3为如下(b3)或(b4):

(b3)序列表的序列8所示的单链DNA分子;

(b4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-FIP为如下(b5)或(b6):

(b5)序列表的序列9所示的单链DNA分子;

(b6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-BIP为如下(b7)或(b8):

(b7)序列表的序列10所示的单链DNA分子;

(b8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-LF为如下(b9)或(b 10):

(b9)序列表的序列11所示的单链DNA分子;

(b10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-LB为如下(b11)或(b12):

(b11)序列表的序列12所示的单链DNA分子;

(b12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子;

所述引物组Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成;

所述引物Ⅲ-F3为如下(c1)或(c2):

(c1)序列表的序列13所示的单链DNA分子;

(c2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-B3为如下(c3)或(c4):

(c3)序列表的序列14所示的单链DNA分子;

(c4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-FIP为如下(c5)或(c6):

(c5)序列表的序列15所示的单链DNA分子;

(c6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-BIP为如下(c7)或(c8):

(c7)序列表的序列16所示的单链DNA分子;

(c8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-LF为如下(c9)或(c10):

(c9)序列表的序列17所示的单链DNA分子;

(c10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-LB为如下(c11)或(c12):

(c11)序列表的序列18所示的单链DNA分子;

(c12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子;

所述引物组Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB组成;

所述引物Ⅳ-F3为如下(d1)或(d2):

(d1)序列表的序列19所示的单链DNA分子;

(d2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-B3为如下(d3)或(d4):

(d3)序列表的序列20所示的单链DNA分子;

(d4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-FIP为如下(d5)或(d6):

(d5)序列表的序列21所示的单链DNA分子;

(d6)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-BIP为如下(d7)或(d8):

(d7)序列表的序列22所示的单链DNA分子;

(d8)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-LF为如下(d9)或(d10):

(d9)序列表的序列23所示的单链DNA分子;

(d10)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-LB为如下(d11)或(d12):

(d11)序列表的序列24所示的单链DNA分子;

(d12)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子;

所述引物组Ⅴ由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB组成;

所述引物Ⅴ-F3为如下(e1)或(e2):

(e1)序列表的序列25所示的单链DNA分子;

(e2)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-B3为如下(e3)或(e4):

(e3)序列表的序列26所示的单链DNA分子;

(e4)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-FIP为如下(e5)或(e6):

(e5)序列表的序列27所示的单链DNA分子;

(e6)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-BIP为如下(e7)或(e8):

(e7)序列表的序列28所示的单链DNA分子;

(e8)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-LF为如下(e9)或(e10):

(e9)序列表的序列29所示的单链DNA分子;

(e10)将序列29经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列29具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-LB为如下(e11)或(e12):

(e11)序列表的序列30所示的单链DNA分子;

(e12)将序列30经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列30具有相同功能的DNA分子;

所述引物组Ⅵ由引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB组成;

所述引物Ⅵ-F3为如下(f1)或(f2):

(f1)序列表的序列31所示的单链DNA分子;

(f2)将序列31经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列31具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-B3为如下(f3)或(f4):

(f3)序列表的序列32所示的单链DNA分子;

(f4)将序列32经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列32具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-FIP为如下(f5)或(f6):

(f5)序列表的序列33所示的单链DNA分子;

(f6)将序列33经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列33具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-BIP为如下(f7)或(f8):

(f7)序列表的序列34所示的单链DNA分子;

(f8)将序列34经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列34具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-LF为如下(f9)或(f10):

(f9)序列表的序列35所示的单链DNA分子;

(f10)将序列35经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列35具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-LB为如下(f11)或(f12):

(f11)序列表的序列36所示的单链DNA分子;

(f12)将序列36经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列36具有相同功能的DNA分子。

所述引物组合的用途为如下(g1)-(g6)中的任意一种:

(g1)鉴别烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus;

(g2)制备用于鉴别烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus的试剂盒;

(g3)鉴定待测微生物是否为烟曲霉或土曲霉或构巢曲霉或黄曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus;

(g4)制备用于鉴定待测微生物是否为烟曲霉或土曲霉或构巢曲霉或黄曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus的试剂盒;

(g5)检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus;

(g6)制备用于检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus的试剂盒。

本发明还保护所述引物组合的应用,为如下(g1)-(g6)中的任意一种:

(g1)鉴别烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus;

(g2)制备用于鉴别烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus的试剂盒;

(g3)鉴定待测微生物是否为烟曲霉或土曲霉或构巢曲霉或黄曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus;

(g4)制备用于鉴定待测微生物是否为烟曲霉或土曲霉或构巢曲霉或黄曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus的试剂盒;

(g5)检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus;

(g6)制备用于检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus的试剂盒。

本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒;所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)或(h3):

(h1)鉴别烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus;

(h2)鉴定待测微生物是否为烟曲霉或土曲霉或构巢曲霉或黄曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus;

(h3)检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法,包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护鉴别烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus的方法,为方法A或方法B。

所述方法A包括如下步骤:以待测曲霉的基因组DNA为模板,分别采用所述引物组合中的引物组Ⅰ至引物组Ⅵ进行环介导等温扩增,如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为烟曲霉;如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为土曲霉;如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为构巢曲霉;如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为黄曲霉;如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为黑曲霉;如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为Aspergillus calidoustus。

所述方法B包括如下步骤:检测待测曲霉基因组DNA中是否含有所述引物组Ⅰ至引物组Ⅵ的靶序列,如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅰ的靶序列,待测曲霉为或候选为烟曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅱ的靶序列,待测曲霉为或候选为土曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅲ的靶序列,待测曲霉为或候选为构巢曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅳ的靶序列,待测曲霉为或候选为黄曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅴ的靶序列,待测曲霉为或候选为黑曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅵ的靶序列,待测曲霉为或候选为Aspergillus calidoustus。

本发明还保护鉴定待测微生物是否为烟曲霉或土曲霉或构巢曲霉或黄曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus的方法,为方法C或方法D。

所述方法C包括如下步骤:以待测微生物的基因组DNA为模板,分别采用所述引物组合中的引物组Ⅰ至引物组Ⅵ进行环介导等温扩增,如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为烟曲霉;如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为土曲霉;如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为构巢曲霉;如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为黄曲霉;如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为黑曲霉;如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为Aspergillus calidoustus,如果采用引物对Ⅰ至引物组Ⅵ均不能实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为非烟曲霉且非土曲霉且非构巢曲霉且非黄曲霉且非黑曲霉且非Aspergillus calidoustus。

所述方法D包括如下步骤:检测待测微生物基因组DNA中是否含有所述引物组Ⅰ至引物组Ⅵ的靶序列,如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅰ的靶序列,待测微生物为或候选为烟曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅱ的靶序列,待测微生物为或候选为土曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅲ的靶序列,待测微生物为或候选为构巢曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅳ的靶序列,待测微生物为或候选为黄曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅴ的靶序列,待测微生物为或候选为黑曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅵ的靶序列,待测微生物为或候选为Aspergillus calidoustus;如果所述基因组DNA中不含有所述引物组Ⅰ至引物组Ⅵ中任一引物组的靶序列,待测微生物为非烟曲霉且非土曲霉且非构巢曲霉且非黄曲霉且非黑曲霉且非Aspergillus calidoustus。

本发明还保护检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus的方法,为方法E或方法F。

所述方法E包括如下步骤:以待测样本的总DNA为模板,分别采用所述引物组合中的引物组Ⅰ至引物组Ⅵ进行环介导等温扩增,如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有烟曲霉;如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有土曲霉;如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有构巢曲霉;如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有黄曲霉;如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有黑曲霉;如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有Aspergillus calidoustus,如果采用引物对Ⅰ至引物组Ⅵ均不能实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中不含有烟曲霉且不含有土曲霉且不含有构巢曲霉且不含有黄曲霉且不含有黑曲霉且不含有Aspergillus calidoustus。

所述方法F包括如下步骤:检测待测样本总DNA中是否含有所述引物组Ⅰ至引物组Ⅵ的靶序列,如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅰ的靶序列,待测样本中含有烟曲霉;如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅱ的靶序列,待测样本中含有土曲霉;如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅲ的靶序列,待测样本中含有构巢曲霉;如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅳ的靶序列,待测样本中含有黄曲霉;如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅴ的靶序列,待测样本中含有黑曲霉;如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅵ的靶序列,待测样本中含有Aspergillus calidoustus;如果所述总DNA中不含有所述引物组Ⅰ至引物组Ⅵ中任一引物组的靶序列,待测样本中不含有烟曲霉且不含有土曲霉且不含有构巢曲霉且不含有黄曲霉且不含有黑曲霉且不含有Aspergillus calidoustus。

以上任一所述方法中,采用所述引物组Ⅰ进行环介导等温扩增时,反应体系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,采用所述引物组Ⅱ进行环介导等温扩增时,反应体系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,采用所述引物组Ⅲ进行环介导等温扩增时,反应体系中引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,采用所述引物组Ⅳ进行环介导等温扩增时,反应体系中引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,采用所述引物组Ⅴ进行环介导等温扩增时,反应体系中引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,采用所述引物组Ⅵ进行环介导等温扩增时,反应体系中引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,环介导等温扩增反应条件为:65℃恒温50min。

本发明还保护所述的引物组Ⅰ或引物组Ⅱ或引物组Ⅲ或引物组Ⅳ或引物组Ⅴ或引物组Ⅵ。

本发明还保护所述引物组Ⅰ在制备试剂盒A中的应用,或,所述引物组Ⅱ在制备试剂盒B中的应用,或,所述引物组Ⅲ在制备试剂盒C中的应用,或,所述引物组Ⅳ在制备试剂盒D中的应用,或,所述引物组Ⅴ在制备试剂盒E中的应用,或,所述引物组Ⅵ在制备试剂盒F中的应用;

所述试剂盒A的用途为如下(i1)或(i2):

(i1)鉴定待测微生物是否为烟曲霉;

(i2)检测待测样本中是否含有烟曲霉;

所述试剂盒B的用途为如下(i3)或(i4):

(i3)鉴定待测微生物是否为土曲霉;

(i4)检测待测样本中是否含有土曲霉;

所述试剂盒C的用途为如下(i5)或(i6):

(i5)鉴定待测微生物是否为构巢曲霉;

(i6)检测待测样本中是否含有构巢曲霉;

所述试剂盒D的用途为如下(i7)或(i8):

(i7)鉴定待测微生物是否为黄曲霉;

(i8)检测待测样本中是否含有黄曲霉;

所述试剂盒E的用途为如下(i9)或(i10):

(i9)鉴定待测微生物是否为黑曲霉;

(i10)检测待测样本中是否含有黑曲霉;

所述试剂盒F的用途为如下(i11)或(i12):

(i11)鉴定待测微生物是否为Aspergillus calidoustus;

(i12)检测待测样本中是否含有Aspergillus calidoustus。

本发明还保护含有所述的引物组Ⅰ的试剂盒A,或,含有所述引物组Ⅱ的试剂盒B,或,含有所述引物组Ⅲ的试剂盒C,或,含有所述引物组Ⅳ的试剂盒D,或,含有所述引物组Ⅴ的试剂盒E,或,含有所述引物组Ⅵ的试剂盒F;

所述试剂盒A的用途为如下(i1)或(i2):

(i1)鉴定待测微生物是否为烟曲霉;

(i2)检测待测样本中是否含有烟曲霉;

所述试剂盒B的用途为如下(i3)或(i4):

(i3)鉴定待测微生物是否为土曲霉;

(i4)检测待测样本中是否含有土曲霉;

所述试剂盒C的用途为如下(i5)或(i6):

(i5)鉴定待测微生物是否为构巢曲霉;

(i6)检测待测样本中是否含有构巢曲霉;

所述试剂盒D的用途为如下(i7)或(i8):

(i7)鉴定待测微生物是否为黄曲霉;

(i8)检测待测样本中是否含有黄曲霉;

所述试剂盒E的用途为如下(i9)或(i10):

(i9)鉴定待测微生物是否为黑曲霉;

(i10)检测待测样本中是否含有黑曲霉;

所述试剂盒F的用途为如下(i11)或(i12):

(i11)鉴定待测微生物是否为Aspergillus calidoustus;

(i12)检测待测样本中是否含有Aspergillus calidoustus。

以上任一所述待测曲霉或待测微生物具体可为烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉或Aspergillus calidoustus。所述烟曲霉具体可为CGMCC,菌株编号:3.08027的烟曲霉。所述土曲霉具体可为CGMCC,菌株编号:3.08115的土曲霉。所述构巢曲霉具体可为CGMCC,菌株编号:3.06379的构巢曲霉。所述黄曲霉具体可为CGMCC,菌株编号:3.06434的黄曲霉。所述黑曲霉具体可为CGMCC,菌株编号:3.06478的黑曲霉。

以上任一所述待测样本具体可为人(Homo sapiens)的痰液。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术,其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下,识别6-8个区域的4-6条引物,在等温条件下快速、特异地扩增目的基因,可推广应用于快速、准确的检测常见的碳青霉烯类耐药基因。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。

本发明提供的引物组合鉴定用于检测常见的六种曲霉菌,具有高特异性和高灵敏度,可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

附图说明

图1为实施例2中采用引物组Ⅰ的检测结果。

图2为实施例2中采用引物组Ⅱ的检测结果。

图3为实施例2中采用引物组Ⅲ的检测结果。

图4为实施例2中采用引物组Ⅳ的检测结果。

图5为实施例2中采用引物组Ⅴ的检测结果。

图6为实施例2中采用引物组Ⅵ的检测结果。

图7为实施例4中样本一的检测结果。

图8为实施例4中样本二的检测结果。

图9为实施例4中样本三的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验澳门彩票,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。

反应液为博奥生物集团有限公司产品,产品目录号为CP.440020。

DNA拷贝数的计算方法如下:

1A260吸光度值=ds DNA 50μg/ml;

核酸浓度=(OD260)×(稀释倍数)×(50)=x ng/μl;

平均分子量(MW)代表克/摩尔,单位道尔顿(dolton),即1dolton=1g/mol;

摩尔=6.02×1023

平均分子量(MW):dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基);

拷贝数计算公式:

(6.02×1023copies/摩尔)×(xng/μl×10-9)/(DNA长度×660)=copies/μl。

实施例1、检测六种曲霉的引物组合的制备

检测六种曲霉的引物组合由六个LAMP引物组组成,每个引物组用于检测一种曲霉。

用于检测烟曲霉引物组如下(5’→3’):

引物Ⅰ-F3(序列1):GGATGCTGACAACAACGG;

引物Ⅰ-B3(序列2):GGTCGAAGACCTTGAAAGCT;

引物Ⅰ-FIP(序列3):TGTTCTCTCCCCTCCCGAGCACCATCGATTTCCCCGG;

引物Ⅰ-BIP(序列4):ATCAGAATTCCTTACCATGATGGCCCGAATTTCCTCTTCGGAGTC;

引物Ⅰ-LF(序列5):TCATACCGAAAGTATCACATA;

引物Ⅰ-LB(序列6):TCGGAAGATGAAGGACAC。

用于检测土曲霉引物组如下(5’→3’):

引物Ⅱ-F3(序列7):GATTGCCTCATGCGACC;

引物Ⅱ-B3(序列8):TTGTTGTCAGCATCAACCTC;

引物Ⅱ-FIP(序列9):GGCCTACATGGTGTTAAATGATCGAATCGATTGCATCGTTCTATGTCG;

引物Ⅱ-BIP(序列10):CACCACCAAGGAGCTGGGAGTTGATCATGTCCTGGAGC;

引物Ⅱ-LF(序列11):ACAGAAGATAAAGTCAAGACTC;

引物Ⅱ-LB(序列12):CAGAACCCCTCCGAGT。

用于检测构巢曲霉引物组如下(5’→3’):

引物Ⅲ-F3(序列13):ACGCGAACTCCCCA;

引物Ⅲ-B3(序列14):GTCATGACGTGACGC;

引物Ⅲ-FIP(序列15):CTGGCCATCATGGTAAGGAACTCATCTACTTCGCACCAGC;

引物Ⅲ-BIP(序列16):AGGACACCGATTCCGAGGAGAGCAGCGGAGATGAAAC;

引物Ⅲ-LF(序列17):TTAGCATTAGTACATTTCT;

引物Ⅲ-LB(序列18):GGCGTTCAAGGTCT。

用于检测黄曲霉引物组如下(5’→3’):

引物Ⅳ-F3(序列19):ATCTCGGATGTGTCCTGTT;

引物Ⅳ-B3(序列20):GATCGGAGGAGCCATTGT;

引物Ⅳ-FIP(序列21):ACACACCGGAGCCGTCAAGATATCTGCCACATGTTTGCT;

引物Ⅳ-BIP(序列22):AAGTACAGCCTGTATACACCTCGACCTTGCCGTCAGATCCATTC;

引物Ⅳ-LF(序列23):GGTTTGCCTGCAAAGTTG;

引物Ⅳ-LB(序列24):ACGAACGACGACCATATG。

用于检测黑曲霉引物组如下(5’→3’):

引物Ⅴ-F3(序列25):CCAGATCACCACCAAGGAG;

引物Ⅴ-B3(序列26):CGAGCCATCATGGTAAGGAATT;

引物Ⅴ-FIP(序列27):GTTGATCATGTCCTGAAGCTCAGACCTCGGCACTGTGATGCG;

引物Ⅴ-BIP(序列28):GACGCTGACAACAACGGAACGATCACAATCCAGCCCGCAT;

引物Ⅴ-LF(序列29):GGTTCTGGCCAAGGGAG;

引物Ⅴ-LB(序列30):CGACTTCCCCGGTATGT。

用于检测Aspergillus calidoustus引物组如下(5’→3’):

引物Ⅵ-F3(序列31):CCCTATTTGTAAGTCG;

引物Ⅵ-B3(序列32):CCTAAACGCATTCACAC;

引物Ⅵ-FIP(序列33):TCACCATCCTTGTCCTGTTCAAAGCACCGATCG;

引物Ⅵ-BIP(序列34):ACTCCGGCAACGTTAAGGCTAATTGATGGGGCTA;

引物Ⅵ-LF(序列35):GAAAAGGGTAAATAA;

引物Ⅵ-LB(序列36):CGCATACGCTCAGC。

用于检测烟曲霉的引物组命名为引物组Ⅰ。

用于检测土曲霉的引物组命名为引物组Ⅱ。

用于检测构巢曲霉的引物组命名为引物组Ⅲ。

用于检测黄曲霉的引物组命名为引物组Ⅳ。

用于检测黑曲霉的引物组命名为引物组Ⅴ。

用于检测Aspergillus calidoustus的引物组命名为引物组Ⅵ。

引物组合中,各单链DNA各自独立包装。

引物组Ⅰ中,引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔比为0.5:0.5:2:2:1:1;

引物组Ⅱ中,引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔比为0.5:0.5:2:2:1:1;

引物组Ⅲ中,引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔比为0.5:0.5:2:2:1:1。

引物组Ⅳ中,引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔比为0.5:0.5:2:2:1:1。

引物组Ⅴ中,引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩尔比为0.5:0.5:2:2:1:1。

引物组Ⅵ中,引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB的摩尔比为0.5:0.5:2:2:1:1。

实施例2、特异性

一、待测样本的制备

待测样本1:烟曲霉(CGMCC,菌株编号:3.08027)基因组DNA;

待测样本2:土曲霉(CGMCC,菌株编号:3.08115)基因组DNA;

待测样本3:构巢曲霉(CGMCC,菌株编号:3.06379)基因组DNA;

待测样本4:黄曲霉(CGMCC,菌株编号:3.06434)基因组DNA;

待测样本5:黑曲霉(CGMCC,菌株编号:3.06478)基因组DNA;

待测样本6:Aspergillus calidoustus检测基因质粒DNA;质粒的制备方法如下:在pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的SacI位点插入Genebank号为HE650910.1的DNA分子,得到重组质粒,该质粒即为Aspergillus calidoustus检测基因质粒。

二、待测样本的检测

以步骤一中的各待测样本为模板,分别采用实施例1制备的引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ和引物组Ⅵ对模板进行环介导等温扩增检测。

反应体系(10μL):7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品,产品目录号:CP.440020)、1μL引物混合物、1μL模板DNA(5pg-50pg),补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ或引物组Ⅵ中的各条引物组成的混合物。反应体系中,引物F3和引物B3的终浓度均为0.5μM,引物FIP和引物BIP的终浓度均为2μM,引物LF和引物LB的终浓度均为1μM。

反应条件:65℃恒温50min。

反应过程中,采用荧光PCR仪检测荧光信号。

如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线),表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线),表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。

采用引物组Ⅰ的结果见图1。结果表明,只有当待测样本为烟曲霉基因组DNA(待测样本1)的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本2、3、4、5或6的时候均不显示阳性扩增曲线。

采用引物组Ⅱ的结果见图2。结果表明,只有当待测样本为土曲霉基因组DNA(待测样本2)的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、3、4、5或6的时候均不显示阳性扩增曲线。

采用引物组Ⅲ的结果见图3。结果表明,只有当待测样本为构巢曲霉基因组DNA(待测样本3)的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、2、4、5或6的时候均不显示阳性扩增曲线。

采用引物组Ⅳ的结果见图4。结果表明,只有当待测样本为黄曲霉基因组DNA(待测样本4)的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、2、3、5或6的时候均不显示阳性扩增曲线。

采用引物组Ⅴ的结果见图5。结果表明,只有当待测样本为黑曲霉基因组DNA(待测样本5)的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、2、3、4或6的时候均不显示阳性扩增曲线。

采用引物组Ⅵ的结果见图6。结果表明,只有当待测样本为Aspergillus calidoustus检测基因质粒DNA(待测样本6)的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、2、3、4或5的时候均不显示阳性扩增曲线。

以上结果表明,本发明提供的曲霉引物组合中的六个引物组分别对其靶标基因有很高的特异性。

实施例3、灵敏性

待测样本1:烟曲霉(CGMCC,菌株编号:3.08027)基因组DNA;

待测样本2:土曲霉(CGMCC,菌株编号:3.08115)基因组DNA;

待测样本3:构巢曲霉(CGMCC,菌株编号:3.06379)基因组DNA;

待测样本4:黄曲霉(CGMCC,菌株编号:3.06434)基因组DNA;

待测样本5:黑曲霉(CGMCC,菌株编号:3.06478)基因组DNA;

待测样本6:Aspergillus calidoustus检测基因质粒DNA;质粒的制备方法如下:在pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的SacI位点插入Genebank号为HE650910.1的DNA分子,得到重组质粒,该质粒即为Aspergillus calidoustus检测基因质粒。

1、将待测样本用无菌水进行梯度稀释,得到各个稀释液。

2、以步骤1得到的稀释液为模板,分别采用实施例1制备的引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ和引物组Ⅵ进行环介导等温扩增。

待测样本为待测样本1时,采用引物组Ⅰ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本2时,采用引物组Ⅱ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本3时,采用引物组Ⅲ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本4时,采用引物组Ⅳ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本5时,采用引物组Ⅴ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本6时,采用引物组Ⅵ进行环介导等温扩增。

反应体系(10μL):7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品,产品目录号:CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为103、5×102、102、5×101或101),补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ或引物组Ⅵ中的各条引物组成的混合物。反应体系中,引物F3和引物B3的终浓度均为0.5μM,引物FIP和引物BIP的终浓度均为2μM,引物LF和引物LB的终浓度均为1μM。

反应条件:65℃恒温50min。

反应过程中,采用荧光PCR仪检测荧光信号。

如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线),表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线),表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。

结果显示,引物组Ⅰ检测靶标基因的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系,引物组Ⅱ检测靶标基因的灵敏度为5×101个拷贝数/反应体系,引物组Ⅲ检测靶标基因的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系,引物组Ⅳ检测靶标基因的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系,引物组Ⅴ检测靶标基因的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系,引物组Ⅵ检测靶标基因的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系。

实施例4、临床样本检测

待测样本为如下样本一、样本二或样本三:

样本一:已测序鉴定确认含有烟曲霉的人的痰液;

样本二:已测序鉴定确认含有黄曲霉的人的痰液;

样本三:已测序鉴定确认含有黑曲霉的人的痰液。

1、提取待测样本的总DNA。

2、以步骤1提取的总DNA为模板,分别采用实施例1制备的各个引物组对这三个样本进行环介导等温扩增,每个引物组合均检测三种样本。

反应体系与反应条件均同实施例2。

反应过程中,采用荧光PCR仪检测荧光信号。

如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线),表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线),表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。

样本一的结果见图7。结果表明只有采用引物组Ⅰ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅰ以外的其它几个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线,与实际情况一致。

样本二的结果见图8。结果表明,只有采用引物组Ⅳ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅳ以外的其它几个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线,与实际情况一致。

样本三的结果见图9。结果表明,只有采用引物组Ⅴ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅴ以外的其它几个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线,与实际情况一致。

以上结果表明,利用本发明提供的曲霉引物组合可以进行6种常见曲霉检测,结果准确可靠。

<110> 博奥生物集团有限公司

<120> 用于检测六种曲霉的LAMP引物组合及其应用

<160> 36

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ggatgctgac aacaacgg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ggtcgaagac cttgaaagct 20

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

tgttctctcc cctcccgagc accatcgatt tccccgg 37

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atcagaattc cttaccatga tggcccgaat ttcctcttcg gagtc 45

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

tcataccgaa agtatcacat a 21

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

tcggaagatg aaggacac 18

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

gattgcctca tgcgacc 17

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

ttgttgtcag catcaacctc 20

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

ggcctacatg gtgttaaatg atcgaatcga ttgcatcgtt ctatgtcg 48

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

caccaccaag gagctgggag ttgatcatgt cctggagc 38

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

acagaagata aagtcaagac tc 22

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

cagaacccct ccgagt 16

<210> 13

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

acgcgaactc ccca 14

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

gtcatgacgt gacgc 15

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

ctggccatca tggtaaggaa ctcatctact tcgcaccagc 40

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

aggacaccga ttccgaggag agcagcggag atgaaac 37

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

ttagcattag tacatttct 19

<210> 18

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

ggcgttcaag gtct 14

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 19

atctcggatg tgtcctgtt 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 20

gatcggagga gccattgt 18

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

acacaccgga gccgtcaaga tatctgccac atgtttgct 39

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 22

aagtacagcc tgtatacacc tcgaccttgc cgtcagatcc attc 44

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

ggtttgcctg caaagttg 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 24

acgaacgacg accatatg 18

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 25

ccagatcacc accaaggag 19

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 26

cgagccatca tggtaaggaa tt 22

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 27

gttgatcatg tcctgaagct cagacctcgg cactgtgatg cg 42

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 28

gacgctgaca acaacggaac gatcacaatc cagcccgcat 40

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 29

ggttctggcc aagggag 17

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 30

cgacttcccc ggtatgt 17

<210> 31

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 31

ccctatttgt aagtcg 16

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 32

cctaaacgca ttcacac 17

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 33

tcaccatcct tgtcctgttc aaagcaccga tcg 33

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 34

actccggcaa cgttaaggct aattgatggg gcta 34

<210> 35

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 35

gaaaagggta aataa 15

<210> 36

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 36

cgcatacgct cagc 14

再多了解一些
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